角膜位于眼球最前端，占有眼球2/3的屈光度。角膜是透明的，具有层状结构。角膜透明是由于基质胶原纤维的特殊排列和没有血管。由于没有血管，角膜和临近组织中促血管生成因子和抗血管生成因子的动态平衡，保持角膜无血管生成，使其为免疫赦免器官。几类因素可能触发此种平衡失衡，促血管发生和/或抗血管生成因子降低，导致角膜新生血管。形成角膜新生血管（cornealneovascularization, CNV）的原因可以是先天性的，如无虹膜；或获得的，如外伤，感染，炎症，变性等，这些因素通过不同机制诱导新血管形成，大多数包括缺氧，炎症和角膜缘干细胞缺乏等。时至今日，CNV确切的机制尚不清楚，然而，几种炎症介导因子和生长因子进入人们视线，血管内皮细胞生长因子（vascularendothelial growth factor, VEGF）家族是新血管形成和生长的关键因素之一。VEGF分为几种亚型因子，VEGF-A在血管生成中是最重要的。负责血管生成的其他因素，包括血小板衍生的生长因子（PDGF），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF），某些白细胞介素和细胞因子等。它们的作用仍然是不明确的。基质金属蛋白酶（MMPs）可以破坏细胞外基质，并促进生成新血管。MMP-2和MMP-9在角膜新生血管向内生长中起重要作用，可作为治疗靶点。全世界约有一千万人因角膜原因失明，是继白内障后的第二个可逆性失明的常见原因。由于生活、卫生条件差和治疗费用昂贵等原因，角膜失明是在发展中国家更为常见。与视网膜变性和青光眼等疾病不同，角膜失明是可以预防的，大多数都是可逆的。改进已有治疗方法和研究新的治疗手段可有效减少因角膜失明的患者。此外提高人群受教育程度，改进生活条件将减少因角膜受累而失明的概率。临床用于CNV的疗法分为两类：药物治疗和手术治疗。药物包括类固醇或非类固醇消炎药物。近期，抗VEGF因子在治疗眼部新生血管中得到广泛应用，包括CNV的治疗，收到了良好的治疗效果，但许多国家尚未批准应用此类药物。一些生物材料治疗和基因治疗在实验中展开，但尚未应用到临床。手术治疗包括激光光凝，光动力疗法，电凝固术和移植疗法。移植物包括角膜的全层或单层，羊膜，结膜，种植口腔粘膜上皮片或角膜缘干细胞。角膜缘干细胞移植主要用于角膜缘干细胞缺乏和角膜新生血管的治疗，有较高成功率。第一次开展角膜缘干细胞移植手术是将来自健眼的角膜缘小片移植到对侧伤眼切口处。现在这种技术经改善后已经实施，包括角膜缘干细胞扩增和借助羊膜，生物支架载体或隐形眼镜等进行移植，临床试验已对此项技术的安全性，可行性和有效性进行调查。角膜缘干细胞移植治疗CNV虽是一种有效方法，但仍有许多弊端，如：需手术才可得到角膜缘小片，所以有炎症和感染等并发症；很多眼部新生血管是双侧发病，得到有用的角膜缘小片组织十分困难。而异体移植又有高免疫排斥风险，尤其对于免疫赦免已经破坏的角膜。由于以上诸多原因，大家不断提出新的治疗方案，干细胞移植可能是其中最适合有效的方法。干细胞是具有自我更新和分化能力的细胞。主要有三种类型：胚胎干细胞（ESC），成体干细胞，诱导多能干细胞（IPS）。IPS和ESC生长较快，多潜能，在适当的刺激条件下可以分化为多种细胞，但由于许多实际问题，限制在临床使用。如：伦理问题，免疫排斥反应和肿瘤发生的风险高。对比ESC和iPS，MSCs是一种在体外分离培养简单，再生能力强，肿瘤形成风险低，不面临伦理问题，更适合于干细胞治疗。已经有许多研究表明，这些细胞具有良好的可塑性，致瘤率低。因此，它们更适用于移植治疗。间充质干细胞可以从多种器官和组织中分离出来，如：骨髓，脂肪组织，牙齿和羊水，脐带，胎盘等。最常使用的是骨髓间充质干细胞（BMSC）。它们具有以下特征：从骨髓中分离，贴壁生长，纺锤形细胞，表达细胞表面标记物CD105，CD90，CD29，不表达CD31，CD45，CD11b等。MSCs可提供神经营养因子，但其整合和分化的能力始终还面临问题。BMSCs适宜自体移植。最近的研究表明，骨BMSCs不表达MHC II类抗原，共刺激分子CD80，CD84或CD40和仅表达少量MHC I类抗原，因此，他们可以对接受者免疫系统是无形的。这使干细胞在自体和异体移植中广泛应用。MSC本身还通过抑制T细胞，B细胞和NK细胞活性抑制免疫系统。从脂肪组织，脐带，羊水和骨髓衍生的MSC显示出大致相同的特性，所以细胞移植可以从医疗废物（吸脂，胎盘，脐带（UC）和分娩后羊水）获得，并安全地用于自体移植。2005-2006年有报告使用MSCs治疗角膜新生血管。在此之后，许多研究团队开始探讨充质干细胞在角膜伤口愈合和角膜血管生成中的作用。至少有35篇发表的报告出现。所有发表的论文均报告间充质干细胞有利于角膜伤口愈合和减少角膜上皮修复时间。研究目的：进一步研究骨髓来源的间质干细胞在角膜新生血管形成和伤口愈合中的作用，并比较不同治疗途径的可行性和有效性。材料和方法：骨髓间充质干细胞来自8日龄Wistar大鼠，体外培养，分离。通过流式细胞术检测表面标志物。第二或第三代细胞通过慢病毒转导的绿色荧光蛋白（GFP）标记。在健康孕妇在知情同意后，获得人羊膜。通过化学和机械方法去除上皮层得到（denuded human amniotic membranes，d-HAM)，BMSCs接种到d-HAM上。共36只雌性Wistar大鼠利用化学伤害诱导法建立角膜新生血管动物模型。动物右眼角膜的中心浸泡在被1mol/L的氢氧化钠水溶液（NaOH）浸湿的直径3mm滤纸30秒，接着用60ml无菌盐水对角膜彻底冲洗1分钟。七天后大鼠随机分为三组：第一组接受结膜下注射溶于PBS中的BMSCs，第二组接受接种BMSCs的D-HAM移植，第三组未接受治疗，作为对照组。角膜上皮缺损面积，基质水肿和沉着混浊形成，新生血管面积用于评价角膜损伤。每天利用直接检眼镜并每周通过裂隙灯观察。四个星期后处死动物。每组五个角膜用于墨汁灌注后铺片，图片进行特殊软件处理，计算新生血管总长度。每组四个角膜提取RNA，利用定量实时聚合酶链反应（Q-PCR）检测VEGF-A的，MMP9， TLR-2和TLR-4表达量。各组中两个角膜通过酶联免疫分析（ELISA）用于VEGF的检测，每组中的一个角膜，做冷冻切片，用于进一步的组织病理学和对VEGF和MMP9的免疫染色。结果：48h后，分离培养的BMSCs细胞清晰可见。传代至第二代和第三代显示间充质干细胞的典型特征：贴壁生张，纺锤状，流式细胞术显示CD90和CD44的阳性表达， CD45和CD11b不表达。细胞进一步转导GFP慢病毒，倒置荧光显微镜下细胞呈绿色荧光。通过DAPI染色和激光共聚焦显微镜证实羊膜上皮层已剥脱。同样证实BMSCs可在D-HAM成长。大鼠造模七天后检查可见角膜混浊，新生血管生长，并用荧光染料证实上皮缺损。检测每个组损伤程度，单因素方差分析结果显示组（P=103，CI95％）无显著区别。四星期后得到的结果，通过ANOVA再次进行比较。该分析显示，组（P=0.002，CI=95％），统计学差异显著，差异在1组和2组，1组和3组和之间。2组和3组之间没有显著差异。因此，单一结膜下注射BMSCs与使用羊膜作为载体移植BMSCs相比，前者对角膜伤口愈合的影响更大。墨汁灌注图片表明，第2组和第3组与第1组相比，新生血管区域和长度更加明显（P=0.01，CI为95％）。用角膜部分H-E染色显示，第1组角膜变薄，基质紧凑，炎性细胞浸润少，上皮层完全康复。DAPI和抗VEGF和抗MMP9抗体免疫染色无明显表达。ELISA试剂盒用于半定量检测VEGF。Q-PCR检测VEGF，MMP9和TLR2和TLR4。统计分析表明，各因素组间有差异，但仅限于VEGF的表达有显著统计学差异（P=0.03，CI=95％）。讨论：角膜病致盲，是可逆性致盲眼病中第二常见原因，世界范围内对社会的经济和心理产生影响。数百万计的患者都是双侧角膜受累致盲，发展中国家人数比例更多。然而角膜失明即使在发达国家也十分严重。许多国际组织，包括世界卫生组织（WHO）都已提出改善这种情况战略。研究者正改善目前的治疗方式和并寻找新的治疗方法。其中包括在角膜新生血管治疗中应用间充质干细胞。许多团体都已开展这项治疗，报告了满意的效果。我们研究的目的是为了进一步探讨骨髓间充质干细胞对角膜新生血管的作用，并以比较几个不同移植途径的效果。我们利用化学烧伤角膜造模，单纯结膜下注射BMSCs和以裸露羊膜为载体，接种BMSCs后移植相比较，之前无相关报告的。我们的主要评估细胞移植后临床效果及其对新生血管形成的影响。我们的研究表明，移植干细胞可增强角膜伤口愈合和减少新生血管生成。令人惊奇的是，简单结膜下注射的BMSCs与羊膜接种干细胞移植相比，前者更有效。我们分析，这种差异可能是因为羊膜存在于角膜表面，4天后大多数羊膜已溶解消失，不能作为干细胞的载体继续发挥作用，所以干细胞失去载体后不能持久的固定在眼表上，故不能继续发挥作用。干细胞是否分化为角膜细胞不是我们的此次研究的重点，我们虽然应用慢病毒GFP标记跟踪移植细胞的运动。然而移植四个星期后，我们无法检测到GFP标记细胞，所以未发现角膜有任何移植细胞。所以BMSCs可能通过局部释放营养因子发挥抗炎效果及抑制新生血管作用。结膜下注射后VEGF和MMP9的表达水平也表现出显著降低。而对于TLR-2和TLR-4的差异不显着，由于未见相关研究的报道，我们得出的结果可能与观察的时间点有关。TLR是负责免疫反应，其表达在炎症开始的阶段增加明显。四周后的炎症已在所有组中显著降低，可能此时Toll样受体的水平已降低到正常水平，所以我们未检测到干细胞治疗对它的具体影响。结论：BMSCs移植能够有效抑制角膜新生血管，单纯结膜下注射BMSCs比羊膜接种BMSCs后移植更有效。