Fastp简介
fastp是一款数据质控过滤软件，作者是陈实富，来自深圳海普洛斯公司。该软件可以实现fastqc-Trimmomatic-fastqc一条龙，操作简单，快速。不仅适用于illumina测序平台，还支持Pacbio和Ion torrent的测序数据。
1 Fastp功能介绍
1.1 过滤
fastp可以对低质量序列，较多N（empty base）的序列进行过滤。该功能默认是启用的，可以使用-Q参数关闭。使用-q参数来指定合格的phred质量值，比如-q 15表示质量值大于等于Q15的即为合格，然后使用-u参数来指定最多可以有多少百分比的质量不合格碱基。比如-q 15 -u 40表示一个read最多只能有40%的碱基的质量值低于Q15，否则会被扔掉。使用-n可以限定一个read中最多能有多少个N。
fastp默认启用了对read长度过滤。可以使用-L参数关闭。使用-l参数指定最低要求一个read有多长，比如-l 30表示低于30个碱基的read会被扔掉。这个功能可以用于实现常用的discard模式，以保证所有输出的序列都一样长。
1.2 接头处理
fastp默认启用了接头（adapter）处理。可以使用-A命令来关掉。fastp可以自动化地查找接头序列并进行剪裁（无需输入任何的接头序列）。对于SE数据，可以-a参数来输入你指定的接头，而对于PE数据则完全没有必要，fastp基于PE数据的overlap分析可以更准确地查找接头，去得更干净，而且对于一些接头本身就有碱基不匹配情况处理得更好。fastp对于接头去除会有一个汇总的报告，如下图所示：
1.3 滑窗质量剪裁
很多时候，一个read的低质量序列都是集中在read的末端，也有少部分是在read的开头。fastp支持像Trimmomatic那样对滑动窗口中的碱基计算平均质量值，然后将不符合的滑窗直接剪裁掉。使用-5参数开启在5’端，也就是read的开头的剪裁，使用-3参数开启在3’端，也就是read的末尾的剪裁。使用-W参数指定滑动窗大小，默认是4，使用-M参数指定要求的平均质量值，默认是20，也就是Q20。
1.4 PE数据的碱基校正
fastp支持对PE数据的每一对read进行分析，查找它们的overlap区间，然后对于overlap区间中不一致的碱基，如果发现其中一个质量非常高，而另一个非常低，则可以将非常低质量的碱基改为相应的非常高质量值的碱基值，如下图所示：
上图中所示的标红的T碱基是低质量序列，和高质量的A不匹配，它会被校正为A。该校正功能默认没有开启使用-c参数可以启用，对于一些对噪声容忍度低的应用，比如液体活检，建议开启。
1.5 全局剪裁
fastp可以对所有read在头部和尾部进行统一剪裁，该功能在去除一些测序质量不好的cycle比较有用，比如151*2的PE测序中，最后一个cycle通常质量是非常低的，需要剪裁掉。使用-f和-t分别指定read1的头部和尾部的剪裁，使用-F和-T分别指定read2的头部和尾部的剪裁。
1.6 polyG剪裁
对于两色发光法的Illumina设备（NextSeq /NovaSeq），因为在没有光信号情况下base calling的结果会返回G，所以在序列的尾端可能会出现较多的polyG，需要被去除。fastp会自动化地识别NextSeq / NovaSeq的数据，然后进行polyG识别和剪裁。如果你想强制开启该功能，可以指定-g参数，如果想强制关闭该功能，则可以指定-G参数。
1.7 分子标签UMI处理
UMI在处理ctDNA类似的超低频突变检测应用中是十分有用的，为了更好地对带UMI的FASTQ文件进行预处理，fastp也很好地支持了UMI预处理功能。该功能默认没有启用，需要使用-U参数开启，另外需要使用--umi_loc来指定UMI所在的位置，它可以是（index1、 index2、 read1、 read2、 per_index、 per_read ）中的一种，分别表示UMI是在index位置上，还是在插入片段中。如果指定了是在插入序列中，还需要使用 --umi_len 参数来指定UMI所占的碱基长度。
1.8 输出文件切分
很多时候我们需要对输出的FASTQ进行切分，分成大小均匀的多个文件，这样可以使用比对软件并行地比对，提高并行处理的速度。fastp软件也提供了相应的功能，并且支持了两种模式，分别是使用参数-s指定切分后文件的个数，或者使用-S参数指定每个切分后文件的行数。
2 Fastp质控报告解读
fastp会生成HTML的报告和JSON格式的报告。fastp的质控报告在单一文件中同时包含了过滤前和过滤后的统计结果，如果是PE数据，则同时包含了read1和read2的统计结果。HTML报告的默认文件名是fastp.html，可以通过-h参数修改，其默认标题为fastp report，可以通过-R参数修改成为我们想要的标题。JSON报告的默认文件名是fastp.json，可以通过-j参数修改。
2.1质量分布曲线图
fastp提供了质量分布曲线，即每一个cycle的平均质量值，fastp同时提供了A/T/C/G四种不同碱基的平均质量，以及总的平均质量，如下图所示：
从上图我们可以看到，一共有5条曲线，分别是A/T/C/G和mean。
2.2 碱基含量分布曲线
和质量分布曲线类似，碱基含量分布曲线也是按照每一个cycle来的，显示了每一个位置的碱基含量。如下图所示：
从图中可以看到，fastp同时显示了A/T/C/G/N/GC的每一个位置的比例和总的比例。
2.3 KMER统计表格
fastp对5个碱基长度的所有组合的出现次数进行了统计，然后把它放在了一张表格中，表格的每一个元素为深背景白字，背景越深，则表示重复次数越多。这样容易发现异常信息。如图所示：
从KMER表格中，可以发现，GGGGG的颜色特别深，从鼠标移上去之后显示的信息可以发现，它的出现次数是平均次数的12.8倍，这是不正常的，因为GGGGG的正常倍数应该在1倍左右。因此就需要过滤掉这种polyG。
更多详情 Github: https://github.com/OpenGene/fastp
3 安装
# conda: 但可能不是最新版本
conda install -c bioconda fastp
## 编译好的二进制版本，只适用于Linux
wget http://opengene.org/fastp/fastp
chmod a+x ./fastp ##没有修改系统变量的情况下， 运行需要添加 ./
## 源码安装 get source (you can also use browser to download from master or releases)
git clone https://github.com/OpenGene/fastp.git
#build
cd fastp
make
#Install
make install
4 用法
4.1 单端测序（SE）
fastp -i input.fastq -o output.fastq
4.2 双端测序（PE）
fastp -i input.fastq -o output.fastq -I input2.fastq -O output2.fastq
4.3 options
usage: fastp -i <in1> -o <out1> [-I <in1> -O <out2>] [options...]
options:
## I/O 相关
-i, --in1 输入read1文件名
-o, --out1 输出read1文件名
-I, --in2 输入read2文件名
-O, --out2 输出read2文件名，软件默认是根据扩展名识别压缩文件，所以输出文件需要加上*.gz扩展名；
-6, --phred64 指定质量体系是phred64。目前主流测序数据都采用phred33，如果从NCBI下载以前hiseq 2000以及之前的数据，可能是Phred 64质量体系。
-z, --compression 输出压缩格式。给定一个数字1-9，调整压缩比率和效率的平衡；
## adapter相关选项
-A 关闭adapter trimming，默认软件会切出adapter，如果设置-A，则关闭这个功能；
-a 给定一个adapter序列文件；
## 全局裁剪选项
-f, --trim_front1 裁剪read1前多少个碱基，默认0；
-F, --trim_front2 裁剪read2前多少个碱基，默认0，如果没有指定，将保持与read1相同设置；
-t, --trim_tail1 裁剪read1末尾多少个碱基，默认0；
-T, --trim_tail2 裁剪read2末尾多少个碱基，默认0，如果没有指定，将保持与read1相同设置；
-b, --max_len1 如果read1比max_len1长，就从末尾截取一段使read1与max_len1等长，默认0，代表没有限制；
-B, --max_len2 如果read2比max_len2长，就从末尾截取一段使read2与max_len2等长，默认0，代表没有限制，如果没有指定，就保持与read1相同设置；
## polyG尾裁剪，针对NextSeq/NovaSeq数据
-g, --trim_poly_g 截取polyG尾，对于Illumina NextSeq/NovaSeq测序数据时默认自动操作的；
--poly_g_min_len 检测read末尾的polyG的长度，默认10；
-G, --disable_trim_poly_g 取消-g的功能；
## polyX tail trimming
-x, --trim_poly_x 截取3'末端polyX
--poly_x_min_len 检测read末尾的polyX的长度，默认10；
## 通过质量值对每条read进行裁剪
-5, --cut_front 从read的5'端至末尾移动窗口，去除窗口中平均质量值小于'<'阈值的碱基；
-3, --cut_tail 从read的3'端值至开头移动窗口，去除窗口中平均质量值小于'<'阈值的碱基；
-r, --cut_right 从read的开头到末尾移动窗口，如果某一窗口的平均质量值小于阈值，去除窗口中的碱基及其右侧部分，并停止；
-W, --cut_window_size 滑动窗口过滤，这个类似于计算kmer，1~1000, 默认是4个碱基；
-M -W选择的窗口中，碱基平均质量值，范围1~36，默认是Q20，如果这个区域窗口平均低于20，则认为是一个低质量区域，处理掉；
## 质量过滤选项
-Q 控制是否去除低质量，默认自动去除，设置-Q关闭；
-q 设置低质量的标准，默认是15，也就是质量值小于15认为是低质量碱基，一般我们设置20，常说的Q20；
-u 低质量碱基所占百分比，并不是包含低质量碱基就把一条reads丢掉，而是设置一定的比例，默认40代表40%，也就是150bpreads，包含60个以上低质量的碱基就丢掉，只要有一条reads不满足条件就成对丢掉；
-n 过滤N碱基过多的reads，如果N碱基含量大于n，这条read/pair将被舍弃，默认5；
## 长度过滤选项
-L 关闭reads长度过滤选项；
-l 接一个长度值，小于这个长度reads被丢掉，默认是15，这个在处理非illumina测序数据时很有用。
## 低复杂度过滤
-y, --low_complexity_filter 使用低复杂度过滤，这里低复杂度的定义是与其下一个碱基不同的碱基比例(base[i] != base[i+1]).
-Y, --complexity_threshold 低复杂度的阈值(0~100)，默认30；
## 根据indexes过滤reads--删除可能的污染
--filter_by_index1 specify a file contains a list of barcodes of index1 to be filtered out, one barcode per line (string [=])
--filter_by_index2 specify a file contains a list of barcodes of index2 to be filtered out, one barcode per line (string [=])
--filter_by_index_threshold the allowed difference of index barcode for index filtering, default 0 means completely identical. (int [=0])
## base correction by overlap analysis options
-c 是对overlap的区域进行纠错，所以只适用于pairend reads。
## UMI processing 分子标签处理
-U, --umi enable unique molecular identifier (UMI) preprocessing
--umi_loc specify the location of UMI, can be (index1/index2/read1/read2/per_index/per_read, default is none (string [=])
--umi_len if the UMI is in read1/read2, its length should be provided (int [=0])
--umi_prefix if specified, an underline will be used to connect prefix and UMI (i.e. prefix=UMI, UMI=AATTCG, final=UMI_AATTCG). No prefix by default (string [=])
--umi_skip if the UMI is in read1/read2, fastp can skip several bases following UMI, default is 0 (int [=0])
# overrepresented sequence analysis
-p, --overrepresentation_analysis enable overrepresented sequence analysis.
-P, --overrepresentation_sampling One in (--overrepresentation_sampling) reads will be computed for overrepresentation analysis (1~10000), smaller is slower, default is 20. (int [=20])
# reporting options
-j, --json 输出json格式报告文件名(string [=fastp.json])
-h, --html 输出html 格式报告文件名，可以用浏览器直接查看(string [=fastp.html])
-R, --report_title should be quoted with ' or ", default is "fastp report" (string [=fastp report])
# threading options
-w, --thread 使用线程数，默认是2(int [=2])
# 控制split选项，有时候单条reads文件太大，可以分割为多份分别比对，在合并bam结果，这样可以提高效率。
-s, --split 切割数目(2~999)，默认是0，不分割
-S, --split_by_lines split output by limiting lines of each file with this option(>=1000), a sequential number prefix will be added to output name ( 0001.out.fq, 0002.out.fq...), disabled by default (long [=0])
-d, --split_prefix_digits 输出前缀位数，默认是4，0001,0002这种命名，如果设置为3，就是001,002这种；
# help
-?, --help 输出帮助信息
更多详情可见github: https://github.com/OpenGene/fastp#adapters
参考
http://www.manongjc.com/detail/18-ncdbgjcabdegvuy.html
https://zhuanlan.zhihu.com/p/33601691
https://www.jianshu.com/p/6f492058da5b
