基础质控:
Call Rate > 99%
单独针对某个点的质控,阈值为0.15(默认值)
修改阈值,可以改变整体的Call Rate,但阈值越低准确性越差。
内参质控
不依赖于样本的内参质控
Staining Controls
Staining controls主要用于检测X染色剂在染色阶段的敏感性和特异性,包括微珠被高强度和低强度(背景)生物素和二硝基苯酚覆盖情况,以及微珠与绿色荧光链霉亲和素和红色荧光抗二硝基苯酚抗体的结合情况。该control不只取决于DNA的杂交效率,还可反映单碱基延伸的情况。
Staining controls检测通道分为红色和绿色荧光信号两部分。红色荧光信号代表二硝基苯酚,绿色荧光信号代表生物素。左图中可看出,红色荧光信号值明显高于其他荧光信号值,其他荧光信号值均在背景信号值范围内;右图片绿色荧光信号值明显高于其他荧光信号值,其他荧光信号值均在均在背景信号值范围内。
图片结果表明本次实验染色正常。
Extension Controls
Extension Controls主要用于检测X染色阶段单碱基延伸的效率。Extension Controls由发夹寡核苷酸组成,必须成功进行单碱基延伸和染色方能体现荧光信号。
Extension Controls检测通道为红色和绿色荧光信号两部分. 其中,红色荧光代表延伸碱基为A或T,绿色荧光代表延伸碱基为C或G。左图中红色荧光信号值(A,T碱基的荧光值)明显高于其他荧光信号值,其他荧光信号值均在背景信号值范围内;右图中绿色荧光信号值(C,G碱基的荧光值)明显高于其他荧光信号值,其他荧光信号值均在背景信号值范围内。
图片结果表明本次单碱基延伸情况正常。
Target Removal Controls
Target Removal Controls主要用于检测单碱基延伸后DNA模板的分离效率。Target Removal controls产生的信号应该在背景信号值范围内。如果靶DNA分离效率很低将会导致信号强度超过背景信号值。
Removal controls检测通道为绿色荧光信号。右图中绿色荧光信号值均在背景值范围内。
图片结果表明DNA模板分离正常。
Hybridization Controls
Hybridization Controls主要用于检测芯片杂交的效率。该control使用靶向合成序列DNA(主要有高5 pM、中1 pM、低0.2 pM三种水平量)代替基因组扩增DNA与微珠进行杂交。其结果不仅取决于杂交效率,还取决于染色阶段的单碱基延伸是否成功。
Hybridization Controls检测通道为绿色荧光信号。右图中高中低三个的信号值呈现三个明显的梯度,且都在正常范围内。
图片结果说明芯片杂交效率没有问题。
Restoration Control
(如果没有用FFPE Restore kit处理的样本可以不关注本部分)
Restoration Control主要用于检测FFPE样本降解DNA的修复情况。Restoration Control将短的寡核苷酸加入到Infinium HD FFPE restore kit中,通过Infinium HD FFPE restore kit的化学反应,在修复正常的情况下,样本中的寡核苷酸就可以和微珠上的探针相结合,产生荧光信号。
Restoration Control检测通道为绿色荧光信号。右图中绿色荧光信号值在背景范围内。
图片结果说明芯片实验没有经过FFPE Restore kit处理。
依赖于样本的内参质控
Stringency Controls
Stringency Controls 主要用于检测杂交的严谨性。严谨的探针杂交主要以靠升高温度和优化杂交缓冲液来完成。该control探针设计包括完美匹配探针(PM,序列与目的基因完美匹配)和错配探针(MM,序列与目的基因不完全匹配)两种。
Stringency Controls检测通道为红色荧光信号。左图中PM探针荧光信号值在正常范围内, MM探针荧光信号值在背景信号值范围内。
图片结果说明芯片杂交的严谨性极高。
Non-Specific Binding Controls
Non-Specific Binding Controls主要用于检测DNA扩增产物杂交的特异性,判断样本DNA的质量,对非人类DNA进行识别。Non-specific Binding Controls中的探针和细菌的序列互补但不能与人类的序列杂交,如果样本有细菌污染将会与control探针(细菌探针)结合而使信号值增强。
Non-Specific Binding Controls检测通道包括红色和绿色荧光信号。下图中,红色荧光信号通道和绿色荧光信号通道中的所有信号值均在背景信号值范围内。
图片结果说明样本质量较好,无细菌污染。
Non-Polymorphic Controls
Non-Polymorphic Controls主要用于检测DNA的扩增情况。该control通过人类基因组非多态区域的特定位点来评估芯片的整体性能(从扩增情况到缺失情况)。
non-polymorphic control检测通道包括红色和绿色荧光信号。其中,A和T使用红色荧光通道检测,C和G使用绿色荧光通道检测。左图中A和T碱基的信号值明显高于其他信号值,其余信号值均在背景值范围内;右图中C和G碱基的信号值明显高于其他信号值,其余信号值均在背景值范围内。
图片结果说明DNA扩增正常。