hello，又到周五，一周的收官之战，今天我们要继续分享单细胞空间联合分析的文章，参考文章在Spatiotemporal Immune Landscape of Colorectal Cancer Liver Metastasis at Single-Cell Level，2021年8月发表于cancer discovery,IF17.40分，我们来看一下这一次运用单细胞空间联合技术给我们带来什么不一样的生物学分析内容。

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ABSTRACT

肝转移是结直肠癌死亡的主要原因，表现出高度异质性和抑制性的免疫微环境。 在这里，使用 single-cell RNA-seq 和空间转录组学对 97 个匹配的样本进行了测序。 Strikingly，转移性微环境经历了免疫抑制细胞（如 MRC1⁺ CCL18⁺ M2 样巨噬细胞）的显著空间重编程。 进一步开发了 scMetabolism，这是一种用于量化单细胞代谢的计算pipeline（这个值得大家注意一下），并观察到这些巨噬细胞具有增强的代谢活性。 有趣的是，新辅助化疗可以阻断这种状态并恢复反应性患者的抗肿瘤免疫平衡，而无反应性患者则恶化为更具抑制性的状态。 研究的工作描述了转移的免疫进化，并揭示了肿瘤如何对新辅助化疗作出反应的black box。

STATEMENT OF SIGNIFICANCE

We present a single-cell and spatial atlas of colorectal liver metastasis and found the highly metabolically activated MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in metastatic sites. Efficient neoadjuvant chemotherapy can slow down such metabolic activation, raising the possibility to target metabolism pathways in metastasis.（解析了结直肠肝转移的单细胞和空间图谱，并在转移部位发现了高度代谢激活的 MRC1⁺ CCL18⁺ M2 样巨噬细胞。 有效的新辅助化疗可以减缓这种代谢激活，提高靶向转移代谢途径的可能性）。

INTRODUCTION

Liver metastasis（肝转移） remains a major hurdle to long-lasting survival of colorectal cancer（结肠癌） patients, which can be partly explained by the highly dynamic spreading routes of cancer cells（癌细胞的高度动态spreading routes ）. Outside the cancer cells, tumor microenvironment (TME) of liver metastasis harbors a highly immunosuppressive phenotype, induces a systemic loss of antigen-specific T lymphocytes, and drives the spread of tumor（免疫细胞失去其功能也是导致肿瘤转移的一个推手）. It still remains largely unknown how the immune cells spatially orchestrate Colorectal Cancer Liver Metastasis (CRLM) progression and whether the metastatic cellular microenvironment differs from the primary ones（看来很多生物学问题必须要借助单细胞空间的联合技术）. There is hence a pressing need for recording, identifying, and quantifying cellular or even spatial landscape of CRLM to refresh our understanding of metastasis biology.

Neoadjuvant Chemotherapy (NAC，新辅助化疗) refers to that chemical drugs are administered prior to surgical removal of a tumor（在手术切除肿瘤之前施用化学药物）. Paradoxical results（矛盾的结果） have been seen for the effect of NAC in CRLM. In some reports, NAC was shown to prolong the progression-free survival and overall survival. However, especially in the low-risk resectable CRLM patients, NAC was unexpectedly associated with an unimproved overall survival（看来肿瘤异质性对药物的反应是不同的）. Another independent group also reported that NAC did not prolong disease-free interval. Those seemingly contradictory data raise a critical but poorly understood question whether NAC could favor anti-tumor response and improve outcome of CRLM patients. Thus, dissecting the precise effect of NAC, especially tumor microenvironment alterations, is crucial for understanding the key mechanisms of NAC and designing novel therapeutic strategies（目前单细胞技术无法临床运用的关键就在于此吧）。

Here, using single-cell RNA-seq (scRNA-seq) and Spatial Transcriptomics (ST) of 97 samples from 24 patients（单细胞空间联合的技术）, we aim to explore the immune atlas of CRLM. We revealed that immune microenvironment showed dynamic cellular and spatial changes from primary to metastatic sites（免疫细胞的特征以及空间动态）. Following NAC treatment, the immune phenotypes underwent antitumor remodelling in responsive patients but shifted towards more immunosuppression in non-responsive patients, where the immunosuppressive cells were reprogrammed at metastatic sites（免疫细胞经历了重编程）. Our findings highlight the favorable effect of efficient NAC treatment in resectable CRLM patients and allow for the data-driven design of novel therapeutic combinations such as NAC plus immunotherapy in selected patients（可以指导临床运用，这个肯定是未来的方向)。

RESULTS

Integrated scRNA-seq and Spatial Transcriptomics Precisely Quantify Immune Cell Diversity in Resectable CRLM

为了定义 CRLM 的single-cell landscape，应用 scRNA-seq 和 ST 来量化 CD45⁺ 细胞动态，使用结直肠癌 (CRC)、邻近结肠、肝转移 (LM) 和邻近肝脏、结肠淋巴结 (LN) 和外周血单核细胞 (PBMC) 的配对样本。 根据严格的标准，总共recruited了 24 名可切除的 CRLM 患者。 如前所述，肿瘤的可切除性都通过了由资深临床医生组成的多学科团队讨论。 具体而言，20名患者的89份样本进行了scRNA-seq，4名患者的8份样本进行了ST测序，其中13名患者的54份样本未接受治疗，6名患者的30份样本接受部分缓解的新辅助化疗（PR )，来自 5 名患者的 13 个样本接受了疾病进展 (PD) 或疾病稳定 (SD) 的新辅助化疗。 所有肿瘤都是microsatellite stable。

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• 注：The experimental scheme for discovering and validating functional immune subpopulations in CRLM.

After two rounds of quality control and doublet removal of scRNA-seq data, 79,703 cells from untreated patients (n = 11), 36,284 cells from NAC PD/SD patients (n = 5), and 62,643 cells from NAC PR patients (n = 4) were used for further analysis. On average, each sample contained 2,007 cells and 1,064 genes (median) were quantified in each cell, with no obvious batch effects across different samples. We integrated all 178,630 CD45⁺ cells, performed the clustering analysis, and defined the main cell types using the SingleR(SingleR定义细胞类型) and cell marker genes（marker 基因也需要额外验证）. Largely consistent with previous scRNA-seq of colon cancer, we identified myeloid cells, CD8⁺ T cells, CD4⁺ T cells, NK cells, and B cells from the CRLM samples. Of note, T cell proportion was obviously distinct across different tissue types, suggesting the tissue heterogeneity of the immune microenvironment. Both CRC and paired LM showed ~10% Treg cells of all CD45⁺ cells, while such cells were scarce in the adjacent normal tissues. This indicated an suppressed intratumor immunity, which was previously ascribed to the reduced immunotherapeutic efficacy in liver metastasis. Likewise, we integrated the SingleR and manual marker-based annotation to further define immune cell subsets for further in-depth analysis.

同时，分析了来自 2 名未治疗患者和 2 名 NAC PR 患者的 8 个样本（配对的 CRC 和 LM）的 ST 数据。无监督聚类分析将样本分为不同的区域，例如肿瘤和成纤维细胞区域。为了整合 scRNA-seq 和 ST 数据，我们使用 Seurat 来量化主要免疫亚群。在未经处理的样本中，我们观察到与 scRNA-seq 一致的免疫细胞模式，例如 CD8⁺ T 细胞在 LM 和 CRC 中的显著富集。相比之下，在 NAC 处理的样本中，观察到较小的肿瘤区域和免疫细胞的不规则分布。特别是在 LM 中，只有一小部分斑点聚集在癌细胞中，表明 NAC 治疗后细胞区室的fundamental remodeling。总之，结果突出了 CRLM 患者的时空动态免疫cell landscape和 NAC 后的huge remodeling。(单细胞 CRLM 图谱现已在线提供，用于探索原发和转移部位的免疫多样性 (http://www.cancerdiversity.asia/scCRLM))。

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Metastatic Tumors Are Enriched with Immune Suppressive Cells, Especially MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like Macrophages

鉴于患者的细胞成分异质性，利用bias-corrected and accelerated (BCa)bootstrap algorithm来估计细胞比例，该算法使用引导重采样 1,000 次来估计与细胞类型比例估计相关的标准误差。分析过滤了低丰度的免疫细胞，聚集了免疫细胞的比例，并在整个组织中对它们进行了scale。一般来说，在未处理的样本中，免疫细胞丰度可分为 6 种不同的模式（邻近结肠直肠高、CRC 高、邻近肝脏高、LM 高、结肠直肠高和肝脏高）。相邻的结直肠样本显示出最高比例的 AIM2⁺ 记忆 B 细胞、TCL1A⁺ 初始 B 细胞和 CD4⁺ 初始 T 细胞，而 CRC 样本主要富含 FOXP3⁺ Treg 细胞。 MAIT 细胞、NK 细胞和 FGFBP2⁺ GZMB⁺ CD8⁺ T 细胞在邻近的正常肝组织中富集，类似于之前在原发性肝癌中的报道。这些结果表明某些免疫细胞的器官特异性分布。有趣的是，PDCD1⁺ CD4⁺ T 细胞和 CTLA4⁺ CD8⁺ T 细胞分别在原发性肿瘤（CD45⁺ 细胞的 2.24% 和 1.49%）和 LMs（CD45⁺ 细胞的 1.17% 和 3.02%）中相对富集，这与其他计算预测一致。这些细胞在 TME 中的共存表明对免疫细胞的common tumor education。相比之下，一些免疫抑制细胞特异地存在于 LM 中，其中观察到 SPP1⁺ 巨噬细胞和 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞的急剧增加。我们query了这种 LM 特异性巨噬细胞的起源，发现特别是 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞具有Kupffer细胞特征，表明它们可能来自肝Kupffer细胞。据报道，中性粒细胞具有潜在的促肿瘤作用，在 LM 中也富集。进一步使用 ssGSEA（一种被证明对 ST 数据稳健的方法）来量化免疫细胞亚群的空间分布。同样，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞和 SPP1⁺ 巨噬细胞在未治疗的 LM 中富集。这些数据与 scRNA-seq 数据部分一致，进一步证实了肝转移中潜在的抑制性 TME。

接下来，试图在另外三个独立的 CRLM cohorts中验证分析的发现。首先，使用多重免疫组织化学 (mIHC) 来量化同一医院另外 27 名 CRLM 患者（n = 18，未治疗；n = 9，NAC-PR）中选定免疫细胞亚群的空间分布。在未处理的样本中，观察到 CRC 和 LM 中 FOXP3⁺ Treg 细胞、MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞和 SPP1⁺ 巨噬细胞的浸润显著增加，这与 scRNA-seq 数据基本一致。其次，利用 ssGSEA 对 CRLM（n = 133）的大量微阵列数据集中的免疫细胞进行评分。由于缺乏邻近组织数据，只能检查原发性和转移性肿瘤之间的细胞丰度。根据scRNA-seq 数据，在该验证cohorts中，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞、SPP1⁺ 巨噬细胞和中性粒细胞在转移性肿瘤中均显著升高。第三，在癌症基因组图谱 (TCGA) CRC cohorts（n = 430）中探讨了 scRNA-seq 定义的免疫细胞亚群的预后价值。 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞和 SPP1⁺ 巨噬细胞在原发性肿瘤中的高评分均预示着预后显著更差。总而言之，CRLM 单细胞和空间免疫landscope可以在独立的cohorts中得到验证，表明数据的稳健性。这些观察结果还假设特定的巨噬细胞亚群可能在 CRLM 的促肿瘤生态位形成中发挥重要作用。

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• 注：Immune Remodeling from Primary Tumor to Liver Metastasis, Especially the MRC1⁺ CCL18⁺ Macrophages. (A) Heatmap showing proportions of immune cell subsets in different tissues. The color represents the scaled cellular proportion. The pattern of immune infiltration can be classified into 6 types, including adjacent colon high, CRC high, adjacent liver high, LM high, colon high, and liver high. (B) The proportions of selected immune cell subsets. The y axis represents the percentage (bootstrap), and x axis represents different tissues. The shaded areas represent the upper quantile and lower quantile bootstrap cell proportions. (C) The spatial transcriptomics of selected immune cell subsets in colon or liver tumor-normal samples. (D) Multiplex immunohistochemistry of FOXP3⁺ Treg cells. The blue arrows represent the FOXP3⁺ Treg cells. (E) Multiplex immunohistochemistry of SPP1⁺ macrophages and MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages. The blue arrows represent the SPP1⁺ macrophages and the yellow arraws represent the MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages. (F) The proportions of SPP1⁺ macrophages, MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages, and FOXP3⁺ Treg cells among all CD45⁺ cells revealed by multiplex immunohistochemistry. The boxplot represents the mean value and the error bar represents the standard error value. **, P < 0.01; **, P < 0.005. P values were determined by Wilcox test. (G) The prognostic value of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in TCGA CRC patients. P values were determined by log-rank test.

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Metastatic Tumor Potentially Educated Macrophages Shift Towards Suppressive Status

鉴于 LM 中巨噬细胞亚群的富集，分析假设那些富含 LM 的巨噬细胞在不同组织中的功能可能不同。因此，进行了基于配体-受体的癌症-免疫串扰分析（细胞通讯），并在原发部位和转移部位之间进行了比较。Strikingly，SPP1⁺ 巨噬细胞和 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞在 LM 和 CRC 之间的所有差异串扰（通讯）细胞类型中排名靠前。这一结果表明，肝转移癌细胞可能优先重编程巨噬细胞并诱导其特定的功能状态，这可能是由于原发性和转移性癌细胞之间的内在差异。值得注意的是，LM 中的转移性肿瘤细胞优先表达配体 CD47，这是一个重要的“don’t-eat-me”的检查点，因此可能通过相应的受体 SIRPA 招募或激活 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞。进一步利用 mIHC 来可视化这些蛋白质，并直接观察 CD47⁺ 肿瘤细胞和 SIRPA⁺ 巨噬细胞之间的串扰。这些特别富含 LM 的配体-受体对为靶向治疗肝转移提供了线索。
为了查明独特的肿瘤微环境imprinted的差异，在 CRC 和 LM 巨噬细胞之间进行了差异基因表达分析。值得注意的是，富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞高度表达了a broad spectrum of key molecules fundamental for macrophage polarization。 APOE作为抗炎和pro-M2转化蛋白，是显著差异表达的基因之一。其他 M2 极化相关基因如 MARCO 在富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞中也显著上调。相比之下，分析发现富含 CRC 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞表现出更高的炎性细胞因子表达，包括 TNF、IL1B、CCL3 和 CCL4。在 SPP1⁺ 巨噬细胞中也观察到这种分子谱的变化，表明巨噬细胞具有从原发部位到转移部位的共同功能变化。然后，通路富集分析显示来自 CRC 和 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞中代谢通路的强烈富集，突出了代谢在决定这些巨噬细胞功能中的基本作用。值得注意的是，发现 CRC 中的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞富含氧化磷酸化，而它们在 LM 中的对应物则以氨基酸代谢为主。这些数据强调，代谢调节可能介导巨噬细胞响应不同微环境线索的表型和功能转变。

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• 注：MRC1⁺ CCL18⁺ Macrophages in Metastatic Tumors Exhibited Terminally Differentiated 965 and Suppressive States. (A) The ranked differential tumor-immune cell crosstalk (LM v.s. CRC ) shows MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages ranked the second among all ligand-receptor pairs. (B) The LM upregulated ligand-receptor crosstalk between MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages and SPP1⁺ macrophages with cancer cells (LM v.s. CRC). The y axis represents the ligand & receptor name,while the x axis represents the tissue. The circle size represents the log normalized P-value while the color darkness represents the log-transformed mean expression of ligand & receptor. (C) Multiplex immunohistochemistry shows the crosstalk between tumor cells and MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages or SPP1⁺ macrophages via the ligand-receptor of CD47-SIRPA. (D) The volcano plot represents the differentially expressed genes of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages between CRC and LM. (E) The selected gene expression of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in CRC and LM. ***, P < 0.005. P values were determined by Wilcox test. (F) Pathway enrichment analysis of highly expressed genes of MRC1⁺ CCL18⁺ M2-like macrophages in CRC and LM respectively. KEGG gene sets were used to perform the pathway enrichment analysis. Only selected pathways were shown.

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scMetabolism: A Computational Pipeline for Quantifying Metabolic Activity Using scRNA-seq Data

以单细胞分辨率挖掘代谢活动仍然具有挑战性，主要是由于缺乏易于使用的计算pipieline。 尽管 Locasale Lab 最近报告了他们基于 ssGSEA 的工作流程，但执行此类分析仍然需要强大的计算背景并且非常耗时。 在这里，分析展示了一个 R 包 scMetabolism，它集成了 dropout 基因插补、代谢量化和数据可视化。 分析证明该工作流程与 Seurat scRNA-seq 工具包具有良好的兼容性，并且广泛适用于 scRNA-seq 数据集。 scMetabolism 的 R 包现在可以在 Github (https://github.com/wu-yc/scMetabolism) 上获得。

scMetabolism 包由三个连续步骤组成

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• 注：The schematic plot of scMetabolism, a pipeline for quantifying single-cell metabolism based on scRNA-seq.
• 首先，scMetabolism 支持基于 ALRA 的 dropout 值的估算。
• 其次，scMetabolism 基于 VISION、AUCell 和 ssGSEA 量化代谢途径活动。整合了报告的基因集并手动审查了来自 KEGG 和 REACTOME 的基因集，以生成高质量代谢基因集的列表。
• 第三，scMetabolism 提供了三种不同的方式，包括箱线图、UMAP/tSNE 图和点图，以可视化单个细胞的代谢多样性。还在 PBMC、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌和睾丸等 4 个不同数据集上测试了 scMetabolism 的准确性（与已发表方法的比较）、一致性（不同方法之间的相关性，如 VISION 和 AUCell）和稳定性（dropout模拟）来测试这条管道的性能。
• 最后，我们开发了一个易于使用的网络服务器 scMetabolism online (http://www.cancerdiversity.asia/scMetabolism/)，供生物学家轻松量化单细胞的代谢活动。

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A Sharp Increase of Metabolic Activity of MRC1⁺ CCL18⁺ Macrophages in Liver Metastasis

为了了解 CRLM 中髓样细胞的代谢情况，首先计算了抑制性巨噬细胞和单核细胞中所有 76 种活跃代谢途径的得分。 其中，选择了前 50% 的可变代谢评分，并根据其平均代谢评分对骨髓细胞（不包括低丰度的骨髓细胞）进行排名。 Strikingly，LM 浸润的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞在所有骨髓细胞中表现出最高的代谢活动，表明它们非常有活力，这可能与其在转移部位的独特功能有关。

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• 注：The metabolic activity analysis of myeloid cells shows that MRC1⁺ CCL18⁺ macrophages and SPP1⁺ macrophages in metastatic tumors have the highest metabolic score. The circle size and color darkness both represent the scaled metabolic score.

MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞的所有代谢相关基因的进一步无监督聚类观察到与周围组织相关的强烈代谢偏好，确定了 42 条代谢途径可能在 CRC 和 LM 浸润的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞中上调。其中，苯丙氨酸代谢有助于产生酪氨酸，在富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞中表达更高。随后仔细研究了差异表达的代谢基因，发现在原发性和转移性浸润的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞中特异性上调的代谢基因，部分是已知药物的靶基因。 GSTO1 是细胞色素 P450 代谢异物的一种酶，在 CRC 和 LM 浸润的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞中显著升高，并与分化相关。 IL4I1 和 MIF 是巨噬细胞激活所必需的基因，也显示出相似的特征。通过使用 mIHC 验证了这些代谢酶并观察到基本一致的结果。

接下来query巨噬细胞的这种高代谢激活状态是否在物种之间是保守的。因此，构建了 CRLM 的小鼠模型，并将 scRNA-seq 应用于原发性/转移性肿瘤。结果，在小鼠 CRLM 模型中发现了类似的巨噬细胞亚群，例如 Mrc1⁺ 巨噬细胞和 Spp1⁺ 巨噬细胞。然而，没有观察到这些巨噬细胞在原发部位和转移部位之间的显著差异比例，可能是由于原发肿瘤是在皮下而不是在结肠中形成的。进一步的代谢量化显示了富含 LM 和 CRC 浸润巨噬细胞的特征代谢状态。分析检查了前 3 条差异表达途径（小鼠模型中的 LM 与 CRC），其中一些在人和小鼠中是保守的。例如，氧化磷酸化和苯丙氨酸代谢在人和小鼠巨噬细胞之间是一致的。苯丙氨酸代谢的关键酶Mif的表达也与人CRLM一致。总之，LM 中的巨噬细胞具有代谢活动的急剧增加，例如苯丙氨酸代谢。抑制这种代谢活动可能会调动抗肿瘤免疫反应来控制晚期 CRC 的肝转移。

为了说明代谢重编程与巨噬细胞表型变化的关联，计算了巨噬细胞的经典表型评分，例如抗原加工和呈递、炎症、血管生成、免疫抑制、吞噬作用、白细胞介素信号通路和补体。事实上，在 LM 中，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞的抗原加工和呈递以及补体活性评分显著增加，SPP1⁺ 巨噬细胞也显示出类似的趋势。某些基因如 HLA-A（MHC I 类分子之一）在富含 LM 的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞中上调。进一步分析了 42 种肿瘤高代谢途径与 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞表型评分之间的相关性。有趣的是，包括戊糖和葡萄糖醛酸相互转化在内的几种巨噬细胞特异性代谢途径与 LM 中的抗原加工和呈递有很强的相关性，但在 CRC 中却很弱。这些数据共同表明代谢在确定 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞表型中的潜在重要作用。

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NAC Responsive and Non-Responsive Tumors Harbor Distinct Immune Dynamics Especially Macrophages

为了探索 NAC 对抗肿瘤免疫的影响，我们使用 TooManyCells（参考文献在TooManyCells identifies and visualizes relationships of single-cell clades） 对所有 CD45⁺ 细胞进行了聚类分析。有趣的是，观察到 CRC 和 LM 之间细胞聚类的强烈差异。为了了解哪些细胞类型发生了变化，计算了bootstrapped cell proportion并进行了差异分析。值得注意的是，NAC 对 TME 的影响是高度特定于细胞类型和context的。通常，在 PR 肿瘤中，NAC 可以下调免疫抑制细胞并激活肿瘤中的细胞毒性细胞。在 LM 中，反应性 NAC 下调 SPP1⁺ 巨噬细胞，但上调细胞毒性 T 细胞，如 GZMK⁺ CD8⁺ T 细胞和 XCL1⁺CD8⁺ T 细胞。特别是，在 NAC-PR 肿瘤中只剩下几个 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞和几十个 SPP1⁺ 巨噬细胞，表明 NAC 在抑制巨噬细胞谱系中的潜在作用。然而，在 PD/SD 肿瘤中，观察到与 PR 肿瘤不同的免疫细胞变化。例如，在LM中浸润的SPP1⁺巨噬细胞和MRC1⁺ CCL18⁺巨噬细胞水平增加，而细胞毒性免疫细胞（即FGFBP2⁺ GZMB⁺ CD8⁺ T细胞）被下调。 这些相反的结果可能是由器官特异性和治疗功效相关的癌细胞的重塑。例如，转移性 PD/SD 癌细胞表现出 DNA 修复和脂肪酸代谢的特异性富集，而转移性 PR 癌细胞与脂肪生成更相关。或者，NAC 治疗也可以直接和差异地调节个体免疫亚群。除肿瘤外，NAC上调邻近正常肝脏中GZMB⁺CD8⁺T细胞的比例，并增加PR患者PBMC中FGFBP2⁺GZMB⁺CD8⁺T细胞的比例。对于 PD/SD 患者，在邻近结肠和肝脏中也观察到 FGFBP2⁺ GZMB⁺ CD8⁺ T 细胞水平降低。总之，结果表明，有效的 NAC 不仅重新编程了肿瘤内免疫平衡，还激活了全身抗肿瘤免疫反应，为支持 NAC 在可切除 CRLM 中的潜在用途提供了证据。

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• 注：Neoadjuvant Chemotherapy Restored the Immune Balance by Activating Cytotoxic Immune Cells and Inhibiting Immunosuppressive Cells in Metastatic Tumors. (A) The cell clustering in chemotherapy PD/SD, and PR tumors are largely different. (B) The dot plot shows the cell composition difference between untreated and NAC-PR tumors. P values were determined by Wilcox test of bootstrap cellular proportion. (C) The dot plot shows cell composition difference between untreated and NAC-PD/SD tumors. P values were determined by Wilcox test of bootstrap cellular proportion. (D) The cellular changes between untreated and NAC-PR tumors. P values were determined by Wilcox test of bootstrap cellular proportion.(E) The cellular changes between untreated and NAC-PD/SD tumors. P values were determined by 1018 Wilcox test of bootstrap cellular proportion. (F)The proportional changes of selected cell types between untreated, PR, and PD/SD samples. ***, adjusted P < 0.005. Adjusted P values were determined by Wilcox test.

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Metabolic Reprogramming of Macrophages Induced by Neoadjuvant Chemotherapy in Responsive Tumors

考虑到 NAC 主要影响髓细胞群，尤其是巨噬细胞，因此query巨噬细胞的轨迹是否由 NAC 编辑。根据接受 NAC 治疗反应来划分骨髓细胞的 UMAP 分布，并确定了 PD/SD 和 PR 样本之间丰富的骨髓表型多样性。在未处理的样本中，可以观察到骨髓细胞的发育轨迹，而 PR 组的骨髓细胞富含单核细胞表型，巨噬细胞的祖细胞状态，表明早期分化状态。 bootstrap 细胞比例差异分析证实了 NAC-PR 肿瘤中巨噬细胞缺乏终末状态，例如 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞和 SPP1⁺ 巨噬细胞的显著下调。相比之下，与未经治疗的肿瘤相比，NAC-PD/SD 肿瘤的 MRC1⁺CCL18⁺巨噬细胞和 SPP1⁺ 巨噬细胞水平显著增加。接下来利用 mIHC 来检查另一个独立队列中的巨噬细胞（n = 18，未处理；n = 9，NAC-PR），证实 NAC-PR LM 中 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞和 SPP1⁺ 巨噬细胞的浸润较低。使用 dynverse 的轨迹推断分析进一步确定了从 S100A9⁺ 单核细胞到 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞的清晰发展轨迹，表明未处理与 NAC-PR 细胞的相反极化。通过关注分别代表 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞和单核细胞的 MRC1 和 S100A9 表达，再次证明化疗反应细胞表现出富含单核细胞的表型。相反，在PD/SD组中，未观察到巨噬细胞的轨迹重编程。结果表明，化疗对巨噬细胞的轨迹阻断是反应性肿瘤独有的。

鉴于转移性肿瘤中 MRC1⁺ CCL18⁺ 和 SPP1⁺ 巨噬细胞数量有限，对未处理和 NAC 处理的样本之间的所有髓细胞进行了通路富集分析，发现 NAC 诱导 PR 和 PD/SD 组 LM 中髓细胞的特定功能变化PR组中的巨噬细胞显示出核糖体基因特征的富集，而PD/SD组中的巨噬细胞与补体和凝血级联相关。然后，专注于代谢变化的 scMetabolism 管道显示 NAC 显著阻止了骨髓代谢，PR 组显示出更多的下调代谢。在 CRC 和 LM 的 PD/SD 和 PR 组的巨噬细胞中，糖酵解和糖异生持续下调。相比之下，PD/SD 组的巨噬细胞也与特定的代谢途径有关，例如 CRC 和 LM 中的磷酸肌醇代谢上调。总之，NAC 对髓系谱系进行了特定的代谢重编程，这可能会扩展我们对 NAC 诱导的抗肿瘤机制的理解，并为可切除的 CRLM 患者提供潜在的治疗方法。

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Immune Microenvironment of Multifocal Metastasis Is Highly Diverse

正如最近报道的multifocal原发性肝癌的异质性 TME 所证明的那样，器官内的很大一部分肿瘤是multifocal，具有多种遗传、分子和免疫学特征。multifocal LM 是否具有多样化的免疫微环境和对化疗的独特反应仍不清楚。为了普遍捕获转移间免疫异质性，对 4 名multifocal LM（P5、P7、P9 和 P10）患者的所有 CD45⁺ 细胞进行了无监督聚类。有趣的是，multifocal转移显示出不同的免疫特征。对于未治疗的患者 (P10)，LM 位点 2 位于相邻肝脏的同一cluster中，而 LM 位点 1 与任何其他样本都不相似。另外 3 个 NAC 治疗的multifocal LM 也具有转移间异质免疫特征。接下来，bootstrap 细胞比例分析表明，在未处理的样本中，免疫抑制细胞在不同 LM 位点之间显著且差异化地浸润，其中 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞在 P10 的 LM 中差异化浸润。它们还具有不同的转移间表型/代谢活性，例如抗原加工和呈递。因此，这种相当大的转移间异质性可能导致对化疗和其他治疗的不同反应，这在临床实践中得到了充分证明。

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DISCUSSION

在这里，使用最先进的高通量 scRNA-seq 和 ST 定义了 CRLM 的细胞和空间免疫landscope。 众所周知，原发性和转移性 CRC 细胞之间的基因组差异相对较低。 然而，分析的数据显示免疫微环境在 LM 中经历了广泛的时空重塑，具有强烈的免疫抑制细胞富集，与之前基于大样本的研究一致。 特别是，MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞显示出终末分化状态，表现出代谢高能表型，并且对新辅助化疗敏感。 我们的研究不仅揭示了以前未被认识的 CRLM 免疫生态系统的多样性，而且还为癌症研究界提供了全面的资源。
通过应用 scMetabolism（一种用于量化 CRLM 数据上单细胞代谢活动的新型 R 包），惊讶地发现抑制性 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞表现出最高的代谢活性，尤其是在转移性肿瘤中，这表明肿瘤内免疫抑制细胞具有高能量 . 然而，化疗后，这些免疫抑制细胞的代谢显著减慢。 例如，对巨噬细胞发育和命运决定至关重要的 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢被 NAC 下调。scMetabolism pipeline不仅揭示了 CRLM 免疫微环境的代谢landscope，而且为发现其他 scRNA-seq 数据集的功能性代谢检查点和途径开辟了新的计算机会。

与晚期卵巢癌中 NAC 相关的免疫激活（NK 细胞浸润增加和 T 细胞寡克隆扩增）相比，惊讶地观察到巨噬细胞的细胞状态在 NAC 反应性患者中重新编程。在 PR 样本中，仅存在一小部分终末抑制性巨噬细胞，如 MRC1⁺ CCL18⁺ 巨噬细胞和 SPP1⁺ 巨噬细胞，而在 PD/SD 样本中观察到相反的趋势。从机制上讲，一种可能性是这种免疫重编程是由癌细胞的化学治疗调节诱导的，另一组也报道了利用离体培养平台的化学调节作用。随着免疫抑制细胞的减少，细胞毒性细胞显著增加，如 XCL1⁺CD8⁺T 细胞。因此，数据显示 NAC 有力地恢复了化疗反应患者的肿瘤内免疫平衡，解码了有利于这些患者新辅助化疗的其他机制。

转移性多灶性肿瘤具有不同的免疫微环境组成。 即使在同一患者的同一组织内，抑制性免疫细胞也具有不同的丰度和不同的功能状态。 至于多灶性肝细胞癌，我们最近报道了不同的病变诱导了异质性 TCR 扩增，这可能会施加免疫选择。 另一个独立的研究小组还发现，在一名患有多灶性病变的高级别浆液性卵巢癌患者中，进行性转移排除了免疫细胞，而退化性病变则被 CD8 T 细胞浸润。 这可以部分解释临床实践中同一患者的多灶性肿瘤的不同药物反应。 我们的数据将允许针对多灶性 CRLM 的最佳合理组合疗法的新设计，例如组合 NAC、代谢检查点抑制剂和免疫疗法。

本文的研究确实有一些局限性。 由于符合纳入标准（化疗方案和样本可切除性）的患者数量有限，我们的 ST 队列中仅招募了 4 名患者。 其次，ST 技术还没有达到单细胞分辨率。 当前的 10X Visium 平台仅支持在每个点估计 1-10 个细胞。 更精确的空间图，例如 Slide-seq 和 DBiT-seq，对于更好地理解如何在治疗上靶向这种复杂疾病的时空异质性至关重要。 第三，化疗如何诱导转移性肿瘤巨噬细胞的功能改变仍不清楚。 需要进一步的实验验证来验证巨噬细胞的这种状态转变是由于分化的改变或种群变化（即巨噬细胞耗竭或单核细胞募集）。

In summary, we present the spatial & cellular atlas of CRLM and pinpoint the functional impacts of neoadjuvant chemotherapy on TME. Our scMetabolism pipeline not only deepens our understanding into the immunobiology of CRLM, but also enables the unbiased discovery of active metabolic states in other complex tissues. These findings provide unique insights into the biology of cancer spreading and raise the possibility to target metabolism pathways in metastasis.

Method（关注一点重点方法）

Cellular proportion analysis

To perform the differential cell-type composition analysis, we utilized scDC algorithm to conduct the bias-corrected and accelerated bootstrap analysis for cell-type proportion comparison. We used the scDC_noClustering function to perform the bootstrap resampling cell-type composition analysis (calCI = TRUE, calCI_method = BCa, nboot = 1000). To find out the tissue specific cellular types, we used the median value of bootstrap resampled cellular composition, filtered the immune cells with low composition, and performed the unsupervised clustering analysis.

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