该文章发表在frontiers in Oncology杂志上的一篇文章，IF=4.137。头颈癌（HNC）的免疫浸润与患者的预后密切相关，然而，之前的研究未能解释免疫系统的多样性细胞类型。本研究的目的是利用CIBERSORT方法揭示癌旁组织和肿瘤组织之间肿瘤微环境（TME）的免疫表型差异，并探讨其治疗意义。
Patterns of Immune Infiltration in HNC and Their Clinical Implications: A Gene Expression-Based Study
HNC的免疫浸润模式及其临床意义:一项基于基因表达的研究
方法步骤
数据来源与数据处理
从TCGA下载了HNC队列的RNA-seq数据（FPKM值），并使用Voom方法对其表达谱进行了标准化。初步筛选后，该研究共纳入了454例患者（11例正常和443例肿瘤，P<0.05），其中包括41例癌旁组织和11例配对的肿瘤组织。
使用CIBERSOFT算法对TIIC****s（肿瘤细胞的免疫细胞）****进行定量
CIBERSOFT是一种基于基因的反卷积算法，它能推断出22种人类免疫细胞类型，并使用547个标记基因的特征来量化每种细胞类型的相对得分。为了增强结果的鲁棒性，CIBERSOFT算法基于Monte Carlo（蒙特卡洛）采样来获得每个样本的反卷积P值。
总T细胞被视作CD8+T细胞、CD4+记忆激活T细胞等细胞比例的总和；总巨噬细胞的比例为M0、M1和M2巨噬细胞比例之和；总B细胞的比例被估计为初始和记忆B 细胞比例之和。
生存分析
首先，作者使用R包“survival”在LM22免疫细胞亚群和OS之间进行了单变量Cox分析和Kaplan-Meier生存分析，筛选出22种可预测预后的人类免疫细胞表型。然后，使用多变量Cox回归分析进一步验证作为预后因素的22种免疫细胞表型。此外，这项研究还探讨了LM22免疫细胞与其他临床信息（如TNM分期，分级）之间的关联。
分子子类的识别
为了进一步探索不同的TME细胞浸润模式，使用R包“CancerSubtypes”中的一致性聚类算法确定了簇数量。为了揭示簇间TME细胞浸润模型的潜在差异，使用未配对的t检验识别了差异表达基因（DEGs）和不同的免疫细胞类型（|log2 fold change|≥0.2，p<0.05）。
功能和通路富集分析
为了揭示TME亚型中DEGs的潜在生物学意义，作者使用R包“ClusterProfiler”进行了GO和KEGG富集分析（FDR<0.05）。另外，从MSigDB数据库下载基因集（c2 curated signatures），进行了基因集变异分析（GSVA）。
结果展示
TME在HNC中的分布及其亚型的临床病理特征
通过CIBERSOFT算法系统地评估了TME细胞浸润模型和特征基因的图谱。图1展示了41个配对的肿瘤样本和11个配对的癌旁样本，显然，在HNC中TME细胞的比例在组内和组间存在显著差异。HNC癌旁组织总T细胞和总B细胞的比例高于肿瘤组织，总巨噬细胞主要分布于癌旁组织（图2）。此外，正常和肿瘤组之间，滤泡辅助T细胞，初始B细胞等发生显著改变，而记忆B细胞，浆细胞等没有明显改变（图3）。
图1
图2
图3
从图4可以看出在HNC配对的癌旁样本中LM22免疫细胞之间呈现多个高度正关，而在肿瘤样本中，这种相关关系有所减少。因此可推断出TME细胞浸润程度的改变直接反映了两组之间的免疫差异。
图4
就临床特征而言，在HNC HPV阳性组织中，CD8+T细胞，调节性T细胞等免疫细胞的比例高于HNC HPV阴性组织；在HNC HPV阴性样本中，M2型巨噬细胞、中性粒细胞等的比例更高（图5）。因此，这些结果表明异常的免疫浸润及其在HNC中的异质性这些调控过程可能在肿瘤的发展中起重要作用，也具有重要的临床意义。
图5
识别预后的LM22免疫细胞亚型
作者进行了单变量Cox回归来筛选所有肿瘤样本中的预后性LM22免疫细胞亚群，结果显示总共有6个免疫细胞亚群（嗜酸性粒细胞、调节性T细胞等）与OS显著相关（p<0.05，图6A）。然后，对上述免疫细胞亚群绘制了Kaplan-Meier曲线图并进行了对数秩检验，结果显示嗜酸性粒细胞、活化的肥大细胞、初始B细胞和滤泡辅助T细胞与HNC患者的OS密切相关（图7）。
图6A
图7
接下来，多变量Cox比例风险回归分析进一步确定了预后的LM22免疫细胞亚群。结果表明，调节性T细胞（Tregs）与改善的预后相关（图6B）。使用ROC曲线评估LM22免疫细胞亚群的预后能力，其AUC如图8所示，相比于其他LM22免疫细胞亚群（AUC>0.05），滤泡辅助T细胞在HNC患者的风险预测中表现的效能最优。
图6B
图8
随后，通过临床特征与LM22免疫细胞亚群之间的相关性来确定其相互关系。经分析，吸烟，TNM分期等临床协变量与LM22免疫细胞亚群没有显著相关性（图9）。在这些临床变量中，放射线，分级和HPV状态与免疫细胞亚群显著相关（图10）。
图9
图10
分子HNC子类中的免疫细胞模式
为了揭示TME在HNC中不同的免疫细胞群浸润情况，对所有肿瘤样本进行无监督一致性聚类来确定HNC的分子分类，通过K值来确定簇的最优数量。在评估了累积分布函数（CDF）曲线和一致性热图下面积的相对变化之后，作者选择了三个簇（K = 3）作为结果（图11）。此外，在图12中可以看出，簇与不同的生存模式相关。与簇I和簇III相比，簇II中的患者预后更好（P <0.001，对数秩检验）。
图11
图12
每个HNC****子组****中基因/LM22免疫细胞组分的差异表达分析
Kruskal-Wallis检验用于识别与每个簇显著相关的定量基因/LM22免疫细胞，这是根据LM22免疫细胞在三个簇中的比例决定的（图13）。
然后，为了寻找HNC分子亚型与衍生亚型特异性生物标志物之间的分子差异，未配对的t检验用于识别与每种亚型显著相关的定量基因。3个簇之间的两两比较，每个簇都能检测到相应的差异表达mRNA（图14）。
图13
图14
分子亚型的识别
3个HNC簇的富集分析表明，最显著的GO terms包括细胞因子活性、免疫/炎症反应和趋化因子活性。此外，KEGG分析产生的所有通路均与免疫反应相关（图15）。
使用R包“GSVA”对三个簇的基因集变异进行分析，从簇1到簇3所富集的通路数量逐渐增加。从图16可以观察到几个标志性的基因集，包括“TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB”和“APICAL_JUNCTION”等。
图15
图16
