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文献信息
【文章标题】Single-cell sequencing of human midbrain reveals glial activation and a Parkinson-specific neuronal state
【发表杂志】Brain（IF：15.255）
【发表时间】2022年4月
【应用技术】10x Genomics snRNA-seq
【关 键 词】帕金森疾病（Parkinson’s disease），小神经胶质细胞（Microglia），中脑黑质（Midbrain substantia nigra），神经退行性疾病（Neurodegenerative diseases）
闪光点
1、 通过特发性帕金森中脑组织单核细胞测序，形成第一个单核RNA测序数据集，细胞注释发现只在疾病组中存在的代表功能失调多巴胺能神经元的细胞群。
2、 通过帕金森患者和对照的分析，发现了小胶质细胞和星形胶质细胞的疾病特异性增加及少突胶质细胞的缺失，拟时分析发现对错误折叠蛋白的应激反应是帕金森炎症信号的主要触发条件。
3、 结合帕金森GWAS数据和具有细胞类型特异性的基因表达模式，分析帕金森风险变异基因的富集情况，将帕金森患病风险与中脑组织中的细胞类型联系起来。
方法与结论
样本：特发性帕金森患者和对照样本的死后中脑组织样本
亮点解析
帕金森病是一种复杂的神经退行性疾病，超过20种基因的突变与该疾病有关。迄今为止，全基因组关联研究已经确定了90个独立的风险相关变异，然而这些变异在疾病发展中的相关作用并不明晰[1-2]。同时以往的研究大都基于 bulk 水平的转录组，或者基于激光捕获显微解剖的多巴胺能神经元细胞分析，未能解开与帕金森疾病相关的不同细胞类型特异性贡献。因此在疾病研究中，单细胞测序可以增加我们从不同类型细胞贡献对疾病影响进行分析的角度[3]。
发现新的细胞类型如何判断来源和注释
对 5 例特发性帕金森患者和 6 例对照样本的死后中脑组织样本进行单核 RNA 测序，通过细胞注释得到 12 个细胞群，其中除了通过基因表达标记的常见细胞类型外，作者发现了一个由 120 个细胞组成的神经元细胞群，其特征为高表达 CADPS2 基因，但无法根据已知的标记基因对其进行注释。并且有意思的是，这些CADPS2high 细胞几乎全部来源于帕金森患者组（图1）。
为了对这群细胞进行注释，首先对基因表达做了分析。这些神经元细胞除了 TH 基因表达较低外，表现出与多巴胺能细胞相似的特征（图2）。此外，CADPS2high 细胞表达的 TIAM1 水平甚至高于多巴胺能细胞。TIAM1 已被确定为 Wnt/Dvl/Rac1 通路的调节因子，该通路控制中脑多巴胺能细胞分化。因此，作者推断 CADPS2high 细胞可能是退化的多巴胺能细胞。
进一步，作者用样本冷冻中脑组织切片进行激光捕获显微解剖（Laser-capture microdissection），包括用于单细胞测序的 1 例患者样本和 1 例对照，以及4例先前没有进行过研究的 4 例患者样本和 4 例对照。从每个样本中，分离出 150 个含神经黑色素的神经元（Neuromelanin-containing neurons），通过数字 PCR 对其进行 CADPS2 基因表达分析，其中β -肌动蛋白作为 house keeping 基因。该实验表明，与具有神经黑色素沉积的对照组多巴胺能细胞相比，帕金森组的 CADPS2 与β -肌动蛋白比例明显更高，表明 CADPS2 高的细胞确实是多巴胺能来源的（图3）。
从不同细胞类型基因表达探究对帕金森疾病的影响
通过帕金森组和对照组中不同细胞亚群的比较，发现帕金森病中脑中，小胶质细胞和星形胶质细胞的比例增加，少突胶质细胞的比例减少。进一步，对这些有比例变化的细胞进行再分群。
以小胶质细胞为例，文章鉴定了七个小胶质细胞亚群，这些亚群以高表达基因进行标记。对由 P2RY12、GPNMB 和 HSP90AA1 高表达定义的三个细胞数量最多的亚群进行拟时分析。结果显示小胶质细胞的激活轨迹从 P2RY12high 细胞跨越到两个激活分支，一个包含 GPNMBhigh 细胞，另一个包含高表达 HSP90AA1 或 IL1B 的细胞（图4）。
进一步，分析小胶质细胞激活轨迹中相关的变化基因，GO 分析显示功能富集于细胞因子分泌和对未折叠蛋白通路的应激反应。为了与帕金森疾病关联，作者将轨迹相关基因与帕金森组差异上调基因取了交集，鉴定出 29 个与特发性帕金森病中脑小胶质细胞差异激活相关的基因。文章同时对星形胶质细胞和少突胶质细胞做了类似的分析。
单细胞基因表达与疾病风险变异结合分析
为了深入了解帕金森病相关遗传变异如何影响中脑细胞，文章对中脑细胞特异性表达基因与帕金森病相关遗传变异进行了富集分析。首先将以往GWAS研究中得到的相关基因标记到参考基因组上，使用MAGMA基因集分析，对每种细胞类型中的差异表达基因或细胞类型特异性表达基因进行分析[4]。
结果显示，帕金森病风险变异与小胶质细胞、神经元、星形胶质细胞和少突前体细胞显著相关。在GO、KEGG和Reactome分析中，发现了多巴胺能细胞中的“磷酸化”和“激酶活性”以及小胶质细胞中的“NLRP3炎性体复合物”等富集，支持了炎症信号在帕金森中的作用（图5）。
详细解析
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参考文献
[1]BlauwendraatC, Nalls MA, Singleton AB. The genetic architecture of Parkinson's disease. Lancet Neurol. 2020;19(2):170-178. doi:10.1016/S1474-4422(19)30287-X
[2] Corces MR, Shcherbina A, Kundu S, et al.Single-cell epigenomic analyses implicate candidate causal variants atinherited risk loci for Alzheimer's and Parkinson's diseases. Nat Genet. 2020;52(11):1158-1168. doi:10.1038/s41588-020-00721-x
[3] Smajić S, Prada-Medina CA, Landoulsi Z, etal. Single-cell sequencing of human midbrain reveals glial activation and aParkinson-specific neuronal state. Brain. 2022;145(3):964-978. doi:10.1093/brain/awab446
[4]deLeeuw CA, Mooij JM, Heskes T, Posthuma D. MAGMA: generalized gene-set analysisof GWAS data. PLoS Comput Biol. 2015;11(4):e1004219. Published 2015 Apr 17.doi:10.1371/journal.pcbi.1004219
