这一讲是介绍单细胞聚类的相关知识点。里面不仅是介绍方法，还有一些相关的原理，每一种cluster是怎么工作的（不是数学公式，而是用图形说明原理），有的地方主讲人讲的太偏于数学原理，我就直接跳过去了。所以如果想了解细节的童鞋可以看看。

视频地址：https://www.youtube.com/watch?v=Qa6k7RIwltg&list=PLjiXAZO27elC_xnk7gVNM85I2IQl5BEJN&index=7

练习地址：https://github.com/NBISweden/excelerate-scRNAseq/blob/master/session-clustering/Clustering.md

之前讲了质量控制、降维，现在这一步就是鉴定你的data里的细胞群。上图就是一个简单的流程图。拿到scRNA-seq 的matrix，这个matrix里含有细胞和features（这里就是基因）。然后你把细胞聚类（clustering），然后你再试着将这些细胞群注释，标注细胞群的名称。

上图就是从QC开始的一个简单的分析流程，图里打√的部分都是之前几讲讲过的，今天要讲的是clustering。那么在讲聚类前，还涉及一步是feature selection。这部分主讲人会在下面讲到。

所以，为什么我们需要做feature selection？这里有一个名词叫curse of dimensionality（有道翻译出来是“维数灾难”，孤陋寡闻的我没听说过这个词。。）。主讲人举了个例子：上图的两张PCA图，左边那个你只用500个基因来分析，你可以得到非常好的clustering；而右边你用2万个基因来分析，你会发现细胞并没有分的很开，比如黑色和灰色的细胞群就没有像左边那样分的很开。所以curse of dimensionality的意思就是：你想看越多的features，那么背景noise就会越大。所以去除一些基因的目的就是提高real 的信号，提高信噪比。另外一个目的就是降低计算的复杂程度。

上图是一个feature selection的方法，你的目的是选出那些在你的dataset里不同细胞之间表达差异最大的那些基因。但是问题是，当你看variance和平均表达量之间的关系，你会发现他们是相互依赖的。所以你第一件事可以做的就是：画变异系数图（变异系数：coefficient of variation）。棕色的点是所有的基因，蓝色的点是spike-in，根据这些你可以fit一个函数在spike-in上（基因和spike-in之间的variation是技术层面的variation）。粉色的点显示的是基因的true variation。但是如果你用的是droplet-base的方法进行测序，是不适用spike-in的，如果是这种情况，你就要根据你所有的基因来估计技术noise。比如下面这种方法：

上图是基于dropout的feature selection的方法。原理我就不听了，听也听不懂。。主要看右下角，蓝色线是根据所有基因评估出来的，类似于上一个方法图里的红色虚线。这里蓝色线右面的黄色点，就是你data里真正的variation.

接下来选主要成分。上图是Elbow plot图，也叫碎石图。这图是对主要成分进行排序。那么排在第一的成分就是你的data里最大的variation。然后你可以选择多少个PC进行下游分析，那么虚线右边的PC就可以忽略不看了。

在这一讲里，主讲人将主要介绍3种聚类的方法。

先看上图，先看看什么是好的聚类，什么是不好的聚类。那你觉得哪一个聚类结果更好呢？很显然，左图的聚类明显比右边的好。为什么呢？因为左图里，同一个圈里的点之间的距离，要明显小于和另一个圈里的距离。而右图并不是。

首先是第一种，Hierarchical clustering，分层聚类。举个简单的例子，8个点分布在二维里。现在我们想把这些点聚类。

首先我们要做的是，把最接近的两个细胞圈在一起。在右边系统树图里，4和2之间连接的高度，代表两个点的距离。

第二步，把离的第二近的两个细胞圈在一起。然后再在右边系统树图里标出5和8的height。

第三步，把4和2的圈与3画在一起，因为这个距离是第三近的。同样的，在右边系统树图里把4，2和3的height标出来。接着用同样的方法，一步一步把系统树画完整：

直到上图，把两个离的较远的群划分在一起，这样cluster就结束了。

如果你想要两个分群，那么可以把系统树从上面切开，这样就得到了两个独立的群。

那么怎么计算两个cluster之间的距离呢？主讲人主要讲了其中的两种：第一种方法是single linkage，这种方法是计算两个cluster里每一个点之间的距离。然后得到最短的和最长的距离，取平均值。

第二种方法是complete linkage。这种方法是计算两个cluster里距离最远的两个点的距离，然后取最小的那个距离。

由于两种方法的不同，可导致你最后的聚类结果的不同。如果你用single linkage聚类，你最终会得到比较“长条”的聚类结果；而complete linkage方法聚类，你会得到比较大的聚类结果。

上面讲了分层聚类方法，现在来讲k-means聚类方法。这种聚类方法是先从data里随机选取两个随机点，这里不是说所有的k-means方法都是先取两个随机点，如果你只想把细胞聚类为2类，那么就随机取2个开始。你想把细胞聚几类，就要随机取几个开始。

然后把其他细胞根据距离每个随机点（prototype）的远近，分配给不同的随机点，形成一个cluster。

之后根据你分的群里每个点的平均距离，更新你的prototype（随机点），所以上图里可以看到，随机点的位置改变了。

由于随机点的位置改变，这时就要忽略你之前的分派了。现在所有的点根据新的随机点，再重新被分派到离自己最近的随机点，形成一个新的cluster。

然后再根据两个cluster里的点的平均距离来更新随机点的位置，上图看到，随机点的位置又变了。

根据这个再次更新的随机点，每个点又会被重新分派给新的cluster。这个过程会被一直重复，直到没有点的分配改变，那么这个循环就会停止。最终的cluster会像下图一样：

但是，k-means聚类方法仍然存在一些缺陷。第一，就是k-means做出来的聚类图，基本上都是圆圈形状的聚类。但是你的dataset不会刚好都是圆圈的那种聚类，比如上图，如果你用k-means聚类，就会得到很奇怪的聚类结果。所以如果你确定你的聚类会得到圆圈形状的结果，用k-means就没问题。

第三种要讲的聚类方法是基于graph的聚类。graph，就是network。它包括节点和边界。

在单细胞的分析里，人们讨论的graph主要分两类。KNN和SNN。这两种很相似，但是还是有不同点。（这里原理实在是听不懂，是和数学模型有关的）像我们经常使用的Seurat包就是基于 graph的方法进行聚类的（下面省略几张PPT是数学模型的，太过于复杂，感兴趣的可以去看视频）

请记住，聚类是非常主观的一个过程。这取决于你使用哪种聚类方法，不同聚类方法给出的结果可能完全不一样。重要的是聚类以后你的实验证明。

还有一个办法可以验证你的clustering是否合适。你可以从你的dataset里得到的cluster中抽出一部分细胞，每个cluster都抽出一部分细胞，组成一个小的dataset，然后把这个小的dataset进行聚类，如果你的小的dataset聚类结果和你的总的dataset聚类结果非常相似，那么你的clustering是比较靠谱的。你可以利用这种方法多重复几次，如果你每一次的聚类结果图形都是一样的，那么这个结果就比较可靠。

请记得：经常要检查你的QC情况。是否有低质量的细胞、是否有线粒体基因、是否有批次效应！因为clustering对于你输入的dataset是非常敏感的，任何干扰都有可能导致结果的不同。

注释你的clusters。这一步是一门“艺术”，会花你很多时间。因为你要找到每一个cluster的差异表达基因或者是marker。所以关于这一步，实在是没有一个统一的标准。