网络世界的发展造成了现在的信息爆炸，只要真心想学，我们能在网上找到各式各样的学习资料。但资料越多，却越迷惑。随着最近对CRISPR的进一步了解，我愈发感受到自己对这个技术的稚嫩，每当我有这种感觉的时候，总会回头不断补充我早就应该配备的背景知识。Addgene网站是我最常用的CRISPR的学习站，上面有非常多优秀的指引和poster，我们可以学习到他人整理好的精准解读和最新进展。今天我看的是CRISPR Guide
目前我对CRISPR技术的大致认知：
1. CRISPR机制：仿照细菌和古细菌对抗噬菌体的免疫系统，根据细菌种类不同，有不同的Cas核酸酶切酶。
2. Cas9（ S. pyogenes Cas9, SpCas9）是我目前接触最多的，不同的Cas9又有不同的功能：
（1）野生型Cas9造成双键断裂，可通过NHEJ或HDR修复方式完成基因编辑；
（2）RuvC和HNH是Cas9造成DSB的功能域，Cas9 nickase（Cas9n）则是Cas9的D10A突变体，它保留了一个核酸酶结构域，生成DNA nick而不是DSB，此外Cas9n的特异性较之野生型更好。
（3）dead Cas9（dCas9）是没有失去内切酶活性的Cas9，尽管dCas9缺乏核酸内切酶活性，但它仍然能gRNA和目标DNA链结合。如果gRNA将dCas9以转录抑制因子/RNA聚合酶定位到靶向DNA，可以用于敲低基因表达。同样可以在dCas9的N和C端上连接入转录激活因子，从而达到激活基因表达的作用。
以上是我记忆中能想到的Cas9类型，但实际上远远不止这些，例如经过修饰后的xCas9可以识别更为广谱的PAM序列，从原来的NGG扩增至NG、GAA和GAT，xCas9不仅仅PAM更为广谱，其编辑特异性也更好。
3. DNA修复方式的不同，则会有不同的效果。例如NHEJ适合构建杂合子null敲除细胞系；有模板的HDR修复方式则可以达到精准编辑的效果。此外，由于细胞周期对DNA修复活性的影响，也会影响基因编辑的效率。
正文开始
CRIPSR guide的架构：
- CRISPR Overview
- Generating a Knockout Using CRISPR
- Enhancing Specificity with Nickases and High Fidelity Enzymes
- Making Precise Modifications Using Homology Directed Repair (HDR)
- CRISPR Base Editing Without Double-Strand Breaks
- Activation or Repression of Target Genes Using CRISPR
- Epigenetic Modifications Using CRISPR
- Multiplex Genome Engineering with CRISPR
- Genome-Wide Screens Using CRISPR
- Visualize Genomic Loci Using Fluorophores
- Purify Genomic Regions Using dCas9
- RNA Targeting
- Cas9 Alternatives for CRISPR Genome Engineering
- Anti-CRISPR
- Plan Your CRISPR Experiment
以下我将摘取个人认为重要并且我尚且不熟悉的部分描述
1. CRISPR Overview （需要达到闭着眼睛就能画出来的效果）
在CRISPR之前，像锌指核酸酶(ZFNs)或转录激活子样效应核酸酶(TALENs)这样的基因组工程方法要求科学家为每个基因组目标设计并生成新的核酸酶对。而CRISPR系统相对简单，包含两个组成部分：一个是导向RNA (gRNA或sgRNA)，另一个是CRISPR相关的内切酶(Cas蛋白)。
gRNA由Cas结合所必的支架序列（scaffold） 和靶向目的基因序列的20个核苷酸组成。CRISPR最初被用于敲除各种细胞类型和生物体中的靶基因，但对各种Cas酶的修饰使CRISPR的应用得以扩展，可选择性地激活/抑制靶基因，纯化DNA的特定区域，在活细胞中成像DNA，并精确地编辑DNA和RNA。
2. Generating a Knockout Using CRISPR--基操
gRNA的特性：
（1）与基因组的其他部分相比，这个序列是独一无二的。
（2）靶序列与相邻基序(PAM)相邻。
Cas9在与靶基因结合后发生二次构象变化，形成核酸酶结构域，称为RuvC和HNH，以剪切DNA。Cas9介导的DNA裂解的最终结果是在目标DNA (PAM序列上游的3-4个核苷酸)内发生双链断裂(DSB)。通过NHEJ和HDR完成DNA修复。
NHEJ修复途径是最活跃的修复机制，它导致DSB位点上的小核苷酸插入或缺失(indels)。在大多数情况下，NHEJ在目标DNA中产生小的indel，导致氨基酸缺失、插入或移码突变，导致目标基因的开放阅读框(ORF)中的过早终止密码子，理想的最终结果是目标基因的功能缺失突变。
关于DNA修复对于CRISPR实验的影响可以移步到我之前整理的文章
CRISPR-Cas9基因编辑不只是剪开DNA这么简单
3. Enhancing Specificity with Nickases and High Fidelity Enzymes--使用Nickase Cas9
由于Cas9n只能形成一个单链小缺口，且DNA并不解链。因此，需要两个相反的Nickases Cas9才能在目标DNA中生成DSB，如果两个Cas9n太远，也不能形成DSB，因此成对Cas9n的使用可用于提高基因编辑的特异性。Nickase系统也可以与HDR介导的基因编辑相结合进行特定的基因编辑。
鉴于Cas9的潜在脱靶效应，科学家们想办法降低Cas9的非特异性。2015年，研究人员利用合理的诱变技术开发了两种高保真Cas9: eSpCas9(1.1)和SpCas9-HF1。
（1）eSpCas9(1.1)含有丙氨酸取代物，削弱了HNH/RuvC沟与非靶标DNA链之间的相互作用，降低了脱靶效应。
（2）SpCas9-HF1也有丙氨酸取代，而丙氨酸取代破坏了Cas9与DNA磷酸基的相互作用。
（3）HypaCas9包含REC3域突变，增加了Cas9的校对和目标识别。
这三种高保真酶比野生型Cas9产生更少的脱靶编辑。相应的其他Cas9变体，如果有感兴趣可以进一步查阅。
4. Making Precise Modifications Using Homology Directed Repair (HDR)
HDR需要有同源臂，而同源臂的长度也决定精准度。但HDR的效率普遍较低(<10%的修饰等位基因)。因此，许多实验室试图调控细胞周期来提高HDR，因为HDR活跃于S期和G2期。涉及NHEJ的化学或遗传抑制基因也可能增加HDR频率。此外，Cas9-CtIP是Cas9与CtIP的融合，CtIP是一种参与双链断裂切除的蛋白，可以提高HDR的效率。
5. CRISPR Base Editing Without Double-Strand Breaks （单碱基编辑，无DSB）
由于HDR效率非常低，胞嘧啶碱基编辑器(CBEs)和腺嘌呤碱基编辑器(ABEs)应运而生。重点是在不形成DSB的情况下完成基因编辑，还可以给予一个模板，完成单等位基因的编辑。
6. Activation or Repression of Target Genes Using CRISPR（重点）
dCas9保留了gRNA靶向目标DNA结合的能力，但却无核酸内切酶活性。
（1）当dCas9结合在DNA的转录起始位点上时，DNA聚合酶难以结合，从而抑制转录。
（2）dCas9也可以与转录抑制因子或激活因子融合，将这些dCas9融合蛋白靶向于启动子区域，可以产生强大的转录抑制(CRISPR interference，或CRISPRi)或下游靶基因的激活(CRISPRa)。
（1）最简单的dCas9激活或抑制基因表达的方案是，将dCas9直接融合到单个转录激活子或抑制子上，如上图A。
（2）表达表位标记的dCas9+抗体激活效应蛋白(如B)。
（3）dCas9串联融合多个不同的激活域(如C。
（4）使用修饰过的支架gRNA和附加的RNA结合辅助激活剂(如SAM激活剂、panel D)共同表达dCas9-VP64。
与Cas9或Cas9 nickase诱导的基因组修饰不同，dCas9介导的基因激活或抑制是可逆的，因为它不会永久地修饰基因组DNA。dCas9还被用于全基因组筛选，以激活或抑制小鼠和人类细胞中的基因表达。
7. Epigenetic Modifications Using CRISPR（新知识点）
灭活Cas酶可以与p300、LSD1、MQ1和TET1等表观修饰基因融合，从而创造可编程的表观工程工具。在而不引起双链断裂的状态下，通过改变基因启动子中胞嘧啶的甲基化状态，或通过诱导组蛋白乙酰化、去甲基化来改变基因表达，这个效果也是可逆的。
8. Multiplex Genome Engineering with CRISPR
同一质粒中表达多个gRNAs，可以靶向多个靶基因，这种CRISPR可应用于：
（1）使用双nickases产生敲除或使用Cas9进行基因编辑。
（2）移除两个gRNA靶位点之间的序列，造成大片段敲除。
（3）同时编辑多个基因。
总的来说就是，想怎么来怎么来。
由于篇幅太长，暂将这Addgene指南分为至少2个部分来介绍（主要是我想去睡觉了，一时半会看不完），以上是第一部分内容，主要是CRISPR的常规操作，而这之后的CRISPR应用则是拉开普通CRISPR和高手CRISPR的地方了（我瞎说，因为我不会）。
