1. 文献怎么用 monocle2 ?

(1) ex1

01.png

02.png

作者处理2种细胞使用的策略还不一样！

• 1. 中性粒细胞 neutrophil 是先subset出来，去除污染细胞，然后Seurat聚类，找类之间 top20 DEG 做 cell order(就是monocle2的排序)；
     根据前体细胞的marker基因的表达，选择那个state为起点。
• 2. 而 monocyte 是subset出cluster1，去除污染细胞，然后像上文一样cluster，然后DEG是 Monocle 的 differentialGeneTest() 找的，过滤条件为 qval<1e-10 and cell>20 这样的基因 order cell；
     起点是包含最多WT库的分支。

(2) ex2

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867417305962

p1.png

Figure 6. The CD8⁺ and CD4⁺ T Cell State Transition Analysis Based on Integrated Expression and TCR Clonality

(A) The ordering of CD8⁺ T cells along pseudotime in a two-dimensional state-space defined by Monocle2. Cell orders are inferred from the expression of most dispersed genes across CD8⁺ T cell populations sans MAIT. Each point corresponds to a single cell, and each color represents a T cell cluster.
// 使用方差最大的基因 dispersed genes，没说多少个。

(B) The same pseudotime plot as in (A) for four clusters of CD4⁺ T helper cells.

(3) ex3

https://www.nature.com/articles/s41586-018-0694-x

To characterize the potential process of T cell functional changes and determine the potential lineage differentiation between diverse T cells, we applied the Monocle (version 2) algorithm⁵⁰ with the top 700 signature genes of CD8⁺ T cells excluding MAIT cells, based on the rank of F statistic generated by ANOVA (Supplementary Table 5).
// 使用ANOVA的F统计量，top 700 个基因。

(4) ex4

https://www.nature.com/articles/s41467-020-20019-0

First, the top 1000 HVGs were selected using the function ‘FindVariableFeatures’ in Seurat v3.

(10) tips

• 建议 过滤、分群、差异基因都在 Seurat 中完成，然后只用 monocle2 做 拟时序分析。
• 不同分组间的细胞尽量不要放在一起做轨迹分析，同一组的生物学重复可以一起分析。明显没有生物学相关性的细胞也不要放在一起做轨迹分析。

2. 从 Seurat 对象新建 Monocle 对象

#' get Monocle2 obj from Seurat obj
#' 
#' version 0.2
#'
#' @param sce Seurat obj
#'
#' @return Monocle2 obj
#' @export
#'
#' @examples
#' cds = Seurat2Monocle2(sce)
Seurat2Monocle2=function(sce, do.init=T){
  # get data
  #expr_matrix=as.matrix(sce@assays$RNA@counts)
  expr_matrix=GetAssayData(sce, assay = 'RNA', slot = 'counts')
  cell_data=sce@meta.data
  gene_data=data.frame(
    gene_short_name=row.names(sce), #must have this column
    row.names = row.names(sce)
  )
  # new obj
  pd <- new("AnnotatedDataFrame", data = cell_data)
  fd <- new("AnnotatedDataFrame", data = gene_data)
  cds <- newCellDataSet(expr_matrix, 
                        phenoData = pd, 
                        featureData = fd,
                        lowerDetectionLimit = 0.5,
                        expressionFamily=negbinomial.size())
  # init processing
  if(do.init){
    cds <- estimateSizeFactors(cds) #add column: Size_Factor
    cds <- estimateDispersions(cds) #Removing 323 outliers 
    cds=detectGenes(cds, min_expr = 0.1) #add column: num_genes_expressed
  }
  print( head(pData(cds)) )
  #
  return(cds)
}

示例:

# subset of Seurat obj 
sce=subset(scObj_nue, idents = c(9,10), invert=T,
           downsample=50)
sce=subset(sce, subset= origin=="APC")
sce #298
DimPlot(sce, label=T, split.by = "origin")


# 1.load data to monocle2
cds = Seurat2Monocle2(sce)
class(cds)

3. 拟时序分析

The ordering workflow
Step 1: choosing genes that define progress
Step 2: reducing the dimensionality of the data
Step 3: ordering the cells in pseudotime

除了第一步比较灵活外，剩下2步是固定的。最后是各种可视化。

(1) step1 获取差异基因列表 DEG list

这个gene list 对拟时序结构具有决定作用。如果结果不理想，这里是优化的重点。

## Trajectory Step 1: choosing genes that define progress----
#第1步) 获取 输入用于排序的基因 symbol list

Monocle官网教程提供了4个选择方法：
    * 选择发育差异表达基因
    * 选择clusters差异表达基因
    * 选择离散程度高的基因
    * 自定义发育marker基因
    
    前三种都是无监督分析方法，细胞发育轨迹生成完全不受人工干预；
    最后一种是半监督分析方法，可以使用先验知识辅助分析。

##1)使用clusters差异表达基因
deg.cluster <- FindAllMarkers(scRNA.Osteoclastic)
diff.genes <- subset(deg.cluster,p_val_adj<0.05)$gene
HSMM <- setOrderingFilter(HSMM, diff.genes)
plot_ordering_genes(HSMM)

##2)使用seurat选择的高变基因
var.genes <- VariableFeatures(scRNA.Osteoclastic)
HSMM <- setOrderingFilter(HSMM, var.genes)
plot_ordering_genes(HSMM)

##3)使用monocle选择的高变基因
disp_table <- dispersionTable(HSMM)
disp.genes <- subset(disp_table, mean_expression >= 0.1 & dispersion_empirical >= 1 * dispersion_fit)$gene_id
HSMM <- setOrderingFilter(HSMM, disp.genes)
plot_ordering_genes(HSMM)


##4) Monocle2 的 differentialGeneTest() 计算的差异基因，比如保留 qval<1e-10 且 cell number >10 的基因
diff_test_res <- differentialGeneTest(cds[expressed_genes,],
                                      fullModelFormulaStr = "~percent.mt")
# 20:35 --> 20:37 特别慢，仅仅1k个细胞就需要10min。

ordering_genes <- row.names (subset(diff_test_res, qval < 0.01))
cds <- setOrderingFilter(cds, ordering_genes)
plot_ordering_genes(cds)

(2). step2 降维

## Trajectory step 2: reduce data dimensionality----
# cds <- setOrderingFilter(cds, ordering_genes)
cds <- reduceDimension(cds, max_components = 2, method = 'DDRTree')

(3). 按照轨迹排序细胞

## Trajectory step 3: order cells along the trajectory ----
cds <- orderCells(cds)

(4). 可视化

plot_cell_trajectory(cds, color_by = "Pseudotime")
plot_cell_trajectory(cds, color_by = "seurat_clusters")

plot_cell_trajectory(cds, color_by = "State")
# "State" is just Monocle's term for the segment of the tree.

## 如何重叠太厉害，还可以分面
plot_cell_trajectory(HSMM, color_by="XXX") +
    facet_wrap(~XXX, nrow=1)

如果自动指定的不对，还可以手动指定哪个 state 是起点。
如果没有时间序列，就需要根据生物学知识找到root。
比如: 高度增殖的祖细胞群产生两种有丝分裂后的细胞。所以根应该有表达高水平增殖标记的细胞。

cds<- orderCells(cds, root_state = 1)
plot_cell_trajectory(cds, color_by = "Pseudotime")

更多可视化函数:

plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "State",cell_size = 0.75) ####以state进行着色
plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "State",cell_size = 0.75)+facet_wrap(~State, nrow = Cluster_num) ##绘制state的分面图

plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "Pseudotime",cell_size = 0.75) ##根据拟时间值着色

plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "Cluster",cell_size = 0.75) ##根据细胞聚类的进行着色
plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "Cluster",cell_size = 0.75)+facet_wrap(~Cluster, nrow =Cluster_num) ###绘制clusster的分面图

plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "seurat_clusters",cell_size = 0.75) +scale_color_manual(values=col) ##如果有Seurat生的rds文件的话，按照seurat中分的群进行着色，如果不想用ggplot的默认色，可以提供颜色列表col list。
plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "seurat_clusters", cell_size = 0.75) + facet_wrap (~seurat_clusters, nrow =Cluster_num) ###按照seurat中分的群绘制分面图。

plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "stim",cell_size = 0.75) ###按照样本进行着色
plot_cell_trajectory(HSMM_myo, color_by = "stim",cell_size = 0.75)+facet_wrap(~stim, ncol = 2)
##绘制样本着色的分面图。

(5) 查看核心基因轨迹

# 根据 cds子集对象 画伪时间上的基因表达
cds_subset <- HSMM_filtered[my_genes,]
plot_genes_in_pseudotime(cds_subset, color_by = "seurat_clusters")
plot_genes_in_pseudotime(cds_subset, color_by =  "State")

(6) 查看核心基因表达热图

diff_test_res = differentialGeneTest(cds[marker_genes,], fullModelFormulaStr="~sm.ns(Pseudotime)")
sig_gene_names = row.names(subset(diff_test_rtes, qval<0.01)) #原文例子是 0.1，是不是太大了？

# 主要是这个基因列表
plot_pseudotime_heatmap(cds[sig_gene_names,], num_clusters=6, cores=1, show_rownames=T)

热图可以采用top50的基因进行展示，当然，也可以自己筛选。
一行为每个基因对应的表达量。一列为一个拟时间点，一个拟时间值可能代表多个细胞。

4. BEAM 分析: 单细胞轨迹的“分支”分析

# 查看分支点：就是黑色圆圈中的白色数字
plot_cell_trajectory(cds, color_by = "State")

# BEAM进行统计分析：我们分析branch_point = 1这个分支处的细胞命名分叉是如何进行的。
BEAM_res = BEAM(cds[expressed_genes, ], branch_point=1, cores=4)

# 对影响分析的基因根据qvalue进行排序
BEAM_res=BEAM_res[order(BEAM_res$qval),]
BEAM_res=BEAM_res[, c("gene_short_name", "pval", "qval")]


# 绘制分支热图
my_branched_heatmap = plot_genes_branched_heatmap(
    cds[row.names(subset(BEAM_res, qval<1e-4)),], 
    branch_point=1,
    num_clusters=4, cores=2, 
    use_gene_short_name=T,
    show_rownames=T)

软件作者是这么说的：Cell fate 1 corresponds to the state with small id while cell fate 2 corresponds to state with bigger id

能自定义颜色吗？如果基因过多，就别不显示了，看不清。

tmp1=plot_genes_branched_heatmap(test[row.names(subset(BEAM_res,qval<1e-4)),],
    branch_point = 1,
    num_clusters = 4, #这些基因被分成几个group
    cores = 1,
    branch_labels = c("Cell fate 1", "Cell fate 2"), #规定标签
    #hmcols = NULL, #默认值
    hmcols = colorRampPalette(rev(brewer.pal(9, "PRGn")))(62), #自定义热图颜色
    branch_colors = c("#979797", "#F05662", "#7990C8"), #pre-branch, Cell fate 1, Cell fate 2分别用什么颜色
    use_gene_short_name = T,
    show_rownames = F,
    return_heatmap = T #是否返回一些重要信息
)

pdf("branched_heatmap.pdf",width = 5,height = 6)
tmp1$ph_res
dev.off()

返回的列表tmp1包含热图对象，热图的数值矩阵，热图主题颜色，每一行的注释（基因属于哪一个group）等信息。
根据行注释提取出基因group，可以去做富集分析，后期加到热图的旁边。像这样:
https://www.cnblogs.com/TOP-Bio/p/14856979.html

gene_group=tmp1$annotation_row
gene_group$gene=rownames(gene_group)

library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
allcluster_go=data.frame()
for (i in unique(gene_group$Cluster)) {
  small_gene_group=filter(gene_group,gene_group$Cluster==i)
  df_name=bitr(small_gene_group$gene, fromType="SYMBOL", toType=c("ENTREZID"), OrgDb="org.Hs.eg.db")
  go <- enrichGO(gene         = unique(df_name$ENTREZID),
                 OrgDb         = org.Hs.eg.db,
                 keyType       = 'ENTREZID',
                 ont           = "BP",
                 pAdjustMethod = "BH",
                 pvalueCutoff  = 0.05,
                 qvalueCutoff  = 0.2,
                 readable      = TRUE)
  go_res=go@result
  if (dim(go_res)[1] != 0) {
    go_res$cluster=i
    allcluster_go=rbind(allcluster_go,go_res)
  }
}
head(allcluster_go[,c("ID","Description","qvalue","cluster")])

(2) 单个基因的伪时间曲线，类似 plot_genes_in_pseudotime()，不同的是该函数显示2个发育路径。

展示具体的基因，这些基因可以是：

• 随拟时序、state而改变的基因（第5步）
• 细胞亚群的marker基因（seurat得到的差异基因）
• 分支点分析得到的分支特异的基因（第6步BEAM函数得到的基因）

We can plot a couple of these genes, such as Pdpn and Sftpb (both known markers of fate in this system), using the plot_genes_branched_pseudotime function, which works a lot like the plot_genes_in_pseudotime function, except it shows two kinetic trends, one for each lineage, instead of one.

另外，可以绘制基因在所有细胞中的表达量在不同分支上的表达量情况。我们可以根据分叉的state位置来判定这个基因对分支的影响。在拟时间分支树构建的过程中，其实是有很多细小的分支，最终被拟合成一条直线，便于可视化的友好性。下图中的Branch表示挑选了两个不同的未被拟合的实际分支。

plot_genes_branched_pseudotime(
    HSMM[rownames(subset(BEAM_res, qval<1e-8)),], 
    branch_point=1,
    color_by="orig.ident",
    ncol=3)

> str(HSMM)



# 示例2
test_genes=c("TFF3","GUCA2B")
pdf("genes_branched_pseudotime.pdf",width = 9,height = 4)
plot_genes_branched_pseudotime(test[test_genes,],
                               branch_point = 1,
                               color_by = "celltype",
                               cell_size=2,
                               ncol = 2)
dev.off()

参考资料

• Very Good 单细胞分析实录(15): 基于monocle2的拟时序分析
• 单细胞之轨迹分析-2：monocle2 原理解读+实操
• 拟时序分析的热图提取基因问题
• monocle分析及结果解读
• scRNA-seq拟时间分析数据处理
• scRNA-seq拟时分析 || Monocle2 踩坑教程