这篇文献学习笔记分享的是一篇蛋白质复合物共翻译组装的文章。文章于2018年发表在Nature上。题目是：Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes
revealed by ribosome profiling。
摘要
在拥挤的细胞环境中，将新合成的蛋白质折叠成天然状态是一项重大挑战，因为非特异性相互作用会导致错误折叠，聚集和降解。细胞通过将合成与多肽折叠结合并使用分子伴侣来保护其共翻译折叠来应对这一挑战。然而，尽管大多数细胞蛋白质组形成寡聚组装体，但人们对折叠的最后一步将多肽组装成复合物知之甚少。在原核生物中，一项概念验证研究表明，异二聚体荧光素酶的组装是一个有组织的共翻译过程。由多顺反子mRNA上编码的亚基在局部空间的翻译促进。然而，在真核生物中，根本上的差异-例如多顺反子mRNA的稀少以及不同的分子伴侣-提出了组装是否也与翻译相协调的问题。在此，作者使用核糖体图谱对真核生物中蛋白质复合物的组装进行了系统和机制性分析。作者确定了来自酿酒酵母的12个寡聚蛋白质复合物的新生亚基在近残基分辨率下的体内相互作用。作者发现9个复合物以共翻译方式组装，非共翻译相互作用的三个复合物由专门的组装伴侣调节。共翻译组装通常单向发生，一个完全合成的亚基与其新生的伙伴亚基结合，从而抵消其聚集倾向。共翻译亚基结合的开始与核糖体隧道处新生相互作用结构域的完全暴露直接一致。核糖体相关的Hsp70伴侣Ssb8与组装相协调。Ssb短暂地参与部分合成的相互作用结构域，然后在伙伴亚基结合开始之前解离，大概是为了防止过早的组装相互作用。作者的研究表明亚基的共翻译相互作用是酵母中异源寡聚体组装的普遍机制，表明蛋白质复合物的翻译，折叠和组装是真核生物中的整合过程。
正文
目的：研究真核生物中蛋白质组装是否起始于翻译中
模型：酿酒酵母12个异源寡聚体复合物：这12种复合物涉及不同的生物学过程，并且是已知的稳定复合物。
测试：进行了选择性核糖体图谱实验(SeRP)：该实验一是需要进行收集核糖体组分进行核糖体测序（即total translatome），二是需要收集核糖体组分后对标签蛋白进行免疫共沉淀再进行测序（即selected translatome）。通过计算selected translatome/total translatome，即可知道标签蛋白参与了哪些新生肽链的共翻译组装。
Part One：
脂肪酸合酶（FAS）：脂肪酸合酶是由6个α亚基和六个β亚基组成的异源十二聚体复合物（α6β6）。
标签：产生了两个菌株，每个菌株在染色体上编码一个C端与GFP融合的FAS亚基，用于免疫纯化。
结果：C末端标记的α亚基(即成熟的α亚基)不参与正在翻译的α或β的核糖体新生链复合物(RNC)。而C末端标记的β亚基参与正在合成的α的RNC，大约有40倍的富集程度，从α亚基的125位残基开始，一直持续到合成结束。
共翻译亚基结合的开始与FAS的结构特征直接相关：它与α的前94个氨基酸（与β的最后389个氨基酸交织在一起）的核糖体暴露相一致。形成一个单一的催化结构域，丙二酰/棕榈酰-转移酶（MPT）结构域。这意味着共翻译组装在MPT结构域形成时开始，两个亚基之间最稳定的界面。
缺失了MPT片段的FAS缺失突变体的SeRP-seq结果显示：MPT的缺失，无论是还是β，都大大减少了共翻译相互作用。
嘌呤霉素的处理可以促使新生肽链的释放，从而利于判断共翻译组装是否依赖于新生肽链。对β亚基进行免疫共沉淀后的RT-qPCR结果显示嘌呤霉素的处理降低了共纯化的α亚基的mRNA水平。
SeRP的实验数据与各个FAS亚基的差异聚集倾向有关，在暴露于各种应力后，α变得非常容易聚集和降解，而β仍然是可溶的。同样，β在缺乏α的突变体中保持稳定，而α在缺乏β的突变体中迅速降解。这些发现支持了一个模型，其中结构稳健的β独立折叠然后作为支架来陪伴不稳定α的共翻译折叠和组装，保护它不聚集。
Part Two：
多氨酰基-tRNA合成酶：是异源三聚体复合物，由甲硫氨酰和谷氨酰tRNA合成酶MetRS和GluRS(分别由MES1和GUS1编码)以及Arc1p辅因子组成，其中MetRS和GluRS都是催化tRNA和其对应氨基酸结合必需的，而Arc1p这用来调节这两种酶的催化活性和亚细胞定位。
标签：产生了三个菌株，每个菌株在染色体上编码一个C末端与GFP融合的复杂亚基。标记不会影响其功能。
结果：GluRS和MetRS呈现共翻译共组装现象，富集程度至少有30倍，分别从GUS1和MES1的密码子的196和168位开始，并持续到合成结束。两个催化亚基也与新生的Arc1p辅因子结合，在Arc1p的密码子160处具有几乎相同的起始点。
对于所有这些新生链，伙伴亚基参与的开始发生在核糖体暴露N末端相互作用结构域时，共享类似的谷胱甘肽-S-转移酶（GST）样折叠。因此，任何一个催化亚基都可以与所有其它亚基共翻译。相反，完全合成的Arc1p主要与新生的GluRS（从密码子143开始）以波动的方式结合，表明这些相互作用与催化亚基相比不太稳定。作者的综合研究表明，多氨酰基tRNA合成酶的组装通过其每个亚基以网格样方式的共翻译相互作用启动，涉及共享的GST样折叠作为组装驱动程序。
GluRS和MetRS都是在葡萄糖耗尽时调节ATP合成酶表达的双功能蛋白。然后Arc1p迅速降解，MetRS重新定位到细胞核，GluRS重新定位到线粒体，由于两个亚基中的每一个的定位信号在三聚体化时都被埋在界面域内，因此推测共翻译组装可通过在有利的条件下优先考虑细胞溶质活性来调节真核细胞中的双重蛋白质靶向。
Part Three：
为了研究共翻译组装机制的普遍性，作者对另外10个复合物进行了SeRP分析，总共分析了由26个单独的亚基组成的12个复合物。作者发现12个复合物中有9个表现出共翻译亚基相互作用，证明了这种组装机制在稳定的胞质复合物中普遍存在，九个复合物中有六个使用定向组装模式，一个特定的亚基在与新生的相互作用伙伴(FAS，NatA，NatB，TRP，CPA，eIF2)结合之前从核糖体中释放出来。
理论上，与完全合成的伙伴相比，共翻译参与的亚基具有更高的错误折叠倾向。为了测试这是否是一种普遍特征，作者对NatA，TRP和CPA的野生型和单亚基缺失菌株中的亚基进行了体内聚集和稳定性测定。作者排除了一些复合物，例如eIF2是必需的亚基，NatB缺失时酵母显示出严重的生长表型。在没有伙伴亚基存在的情况下，所有测试的新生参与的亚基确实容易聚集或降解。相比之下，仅在从核糖体释放后才结合的亚基在没有伙伴亚基的情况下更易溶解和稳定。作者的研究表明特别是易于聚集的亚基与它们的伙伴亚基共翻译。
三个复合物不表现共翻译组装：①20S蛋白酶体亚基α1,2 ②V型ATP酶催化六聚体(A3，B3) ③核糖核苷酸还原酶RNP(Rnr2p和Rnr4p复合物)。所有这三种复合物都受到专用组装伴侣或抑制剂的严格控制。作者推测这些专用的组装因子具有共翻译功能，保护亚基免于错误折叠和过早与其伙伴亚基结合。
本研究中确定的所有14个亚基的位置解析共翻译相互作用谱使我们能够揭示组装过程的一般特征。作者发现相互作用的开始各不相同，但它们通常是稳定的，一直持续到合成结束。对新生链特征的分析表明，包含极端C末端相互作用结构域的亚基被排除在外。在几乎所有的复合物中，当一个完整的相互作用结构域和额外的24-37个氨基酸被合成时，亚基就会参与。真核生物核糖体隧道容纳大约24个扩展构象的氨基酸和大约38个α-螺旋构象的氨基酸。因此，组装的急剧开始与核糖体出口隧道中整个界面域的出现直接相关。总之，界面结构域的共翻译折叠促进了组装。
Part Four：
Hsp70家族成员Ssb促进了酵母中新生多肽的折叠，这是主要的核糖体相关伴侣。Ssb通过RAC复合物和直接接触出口隧道靶向核糖体，确保对短的疏水性新生肽链具有高亲和力。这提出了Ssb的结合如何与共翻译复合物组装相关的问题。Ssb SeRP相互作用谱的分析表明，所有与伙伴亚基结合的新生链都有一个或多个Ssb结合峰。Ssb在共翻译组装之前结合14个亚基中的13个，通常在相互作用域的合成期间，并在亚基结合之前解离。因此Ssb的参与与组装很好地协调。Ssb能掩盖相互作用域内的疏水模块，保护它们免受非特异性相互作用和错误折叠。Ssb在这些结构域完全暴露于核糖体后解离，允许共翻译折叠和亚基连接。
作者通过蛋白质组范围的生物信息学分析进一步研究了Ssb与组装的相互作用，识别了所有假定的共翻译组装亚基。Ssb与这些ORF和/或新生链结合的metagene分析表明：Ssb通常在预测的共翻译组装起始位置之前解离，其特点此处的疏水性低，低疏水性不利于Ssb结合，相反，允许界面域折叠和亚基相互作用。为了直接评估Ssb对共翻译组装的影响，作者尝试在ssb1△ssb2△细胞中进行SeRP实验，然而，这些实验一再失败，因为与标记亚基共纯化的核糖体数量很少。尽管如此，这些结果与ssb在共翻译组装中的重要作用是一致的，因此，ssb1△ssb2△突变体显示出新合成蛋白质的广泛聚集。其中，复合物亚基被富集，包括这里分析的大多数复合物亚基。
Part Five：
除了复合物的组装，作者假设共翻译相互作用可能扩展到所有的蛋白质-蛋白质互作网络。作者通过识别数据集中蛋白质组学范围内某些亚基的新生链相互作用来测试这种可能性，重点是酶途径的组装。作者采用了最近开发的峰值检测算法，以识别局部结合峰，这些峰被定义为超过10个密码子的三倍以上足迹密度的富集。对于FASβ，PFKβ，Cpa2亚基，作者检测到与已知功能相关或亚基直接相互作用的不同RNC集的额外瞬时相互作用。一个例子是FASβ，它与新生的乙酰辅酶A羧化酶（Acc1p）结合，在通路中，Acc1p催化步骤直接先于FASβ。与FASβ和新生α用于组装的稳定结合不同，它与新生Acc1p的关联是短暂的，类似于之前报道过的完全合成的FAS与Acc1p之间的相互作用。尽管如此，它是特定的，因为β不参与脂肪酸合成途径的任何其它新生成员。这些发现提供了第一个证据表明代谢途径可以协同翻译。
