本文为学习RNA-seq中** Transcript quantification / Differential gene expression analysis **过程记录。

Transcript quantification

转录本的定量是RNA-seq的基础，其接受的输入是 raw counts of mapped reads，输出是 the number of reads that map to each transcript。
这个步骤的主要困难是同一个基因的不同转录本之间的差别很小，他们之间的很多外显子都是共用的，因此，同一个read并不能完全确定是来自于哪一个转录本。
解决这个问题的主流算法是Expectation Maximization。Top hat 和RSEM的核心算法都是最大似然。这里以RSEM为例，RSEM并不是只用到了最大似然，而是也用到了先验概率

The primary parameters of the model are given by the vector θ, which represents the prior probabilities of a fragment being derived from each transcript.

根据文章的说法，输入模型的参数是每一个read出自transcript的先验概率。

The model consists of N sets of random variables, one per sequenced RNA-Seq fragment. For fragment n, its parent transcript, length, start position, and orientation are represented by the latent variables G n , F n , S n and O n respectively.

模型中用到的变量分为观测变量和隐变量。通过对隐变量的迭代，算出可以使出现观测变量可能性达到最大的组合。

在获得raw count之后，还不能直接用来差异表达，因为这些值之间差别的原因不仅有各个基因之间表达量的差异，还会受到转录本长度，测序深度，测序系统偏差等的影响。
这个问题的解决方法是normalize标准化。目前有几种常用的标准化方法：FPKM,RPKM,TPM,TMM等等。其中前两个只能用于样品内部表达量的比较，后两种可以用来进行样品间的比较。
通过一系列的方法得到每个transcript的count之后，可以进行下一步的分析。

Differential gene expression analysis

这一过程的任务是找出在样品间，由于受到控制变量的影响而出现了差异表达的基因。接受的输入是比对到每个transcript的read count。
为什么不能直接用read count的比例来作为差异表达的依据呢？这是因为RNA-seq相当于一个抽样的过程，我们得到的只是总体的样本，我们要做的是根据这个样本对总体的情况进行推断。这个总体值得就是某个基因的表达情况，在目前主流的假设条件下，这个总体服从的是泊松分布或是负二项分布，我们的任务就是推断这个总体的均值，方差等等，并根据这些信息检测两个总体是否有差异。
将总体假设为泊松分布或是负二项分布的理由是：从一个样品池中随机抽取一个read属于某一个transcript的概率很小，且每次抽取之间相互不影响。负二项分布可以看作是泊松分布的扩展版，它增添了一个新的参数，disperison，这个参数可以描述总体的离散情况。
利用这些模型和假设，可以在每个transcript的read count和表达比例之间建立联系，并求解出abundance。（线性模型）
另外，有些方法没有使用离散分布的模型，而是直接对read count执行一些标准化的处理，变化后作为abundance使用。
还有些方法使用的是non-parametric approaches。这些检验方法不要求或者不假定总体是一个什么样的分布，但同时也会因此而损失一些信息。
鉴于目前存在的很多种不同的方法，靠谱的做法是使用不同的方法，并依据不同的实验需求使用这些结果。比如，保守的方法：可以区并集，激进的方法：可以取交集等等。