Immunoreactivity against fibroblast growth factor 8 in alveolar rhabdomyosarcoma patients and its involvement in tumor aggressiveness
肺泡横纹肌肉瘤患者对成纤维细胞生长因子8的免疫反应性及其对肿瘤侵袭性的影响
发表期刊：Oncoimmunology
发表日期：2022 Jul 6
影响因子：7.723
DOI: 10.1080/2162402X.2022.2096349
一、背景
横纹肌肉瘤 （RMS） 是一种侵袭性小儿软组织肉瘤，其特征是一线治疗后复发时预后非常差。因此，患者管理的一个主要挑战仍然是识别与难治性和进行性疾病相关的标志物。在这种情况下，癌症自身抗体是疾病发作和进展的自然标志物，可用于揭示新的治疗靶点。
FGF8最初被描述为一种雄性激素诱导的生长因子，来自小鼠乳腺癌细胞SC-3的条件培养基，是一种分泌的糖蛋白，属于人类成纤维细胞生长因子（FGFs）的大家族。FGF8基因经过选择性剪接，在人类中产生了四个异构体（a、b、e和f）。其中FGF8b具有最大的有丝分裂和转化活性，在胚胎发生过程中起着重要作用，同样已被证明在几种激素相关和非相关癌症中过度表达。
二、材料与方法
1.数据来源
1）RMS患者的48份血浆样本和50例肿瘤活检样本；在疾病复发时还收集了12个匹配的肿瘤样本；15名小儿健康受试者（HS），12名男性和4名女性作为对照
2）48未经治疗的份血液样本
3）人类RH30、RD、MCF-7和A549细胞系
2.实验流程
1） 酶联免疫吸附试验(ELISA)、抗FGF8的间接ELISA检测
2） 总IgG测量
3） 定量RT-PCR、细胞裂解、免疫印迹和免疫沉淀
4） 免疫组化、免疫细胞化学、免疫荧光、伤口愈合试验、细胞存活率测定
5） 统计学分析：Mann-Whitney检验或单因素方差分析检验、Wilcoxon秩检验；生存分析；Cox单变量和多变量比例危险分析
三、实验结果
01 - 极高危RMS患者的FGF8自身抗体及其预后作用
为了确定高危RMS患者的异常调控蛋白，作者通过免疫反应结合分析（IRBP），将先前在转移性PAX3-FOXO1阳性（PF+）ARMS中发现的肿瘤抗原与PAX3-FOXO1融合蛋白调控下的基因进行交叉检查。为了验证肿瘤来源的FGF8免疫反应性并排除炎症作为产生自身抗体的一般机制，作者使用内部ELISA检测作为金标准技术，将抗FGF8自身抗体值与患者的总浆液IgG进行标准化。通过IRBP分析证实了血浆样本中检测到的FGF8自身抗体的存在（图1c），并证实了患者和对照组之间的明显差异（图1d；健康受试者，HS）。相比之下，两组的总IgG水平相近，支持FGF8自身抗体的抗肿瘤作用，而不是简单地反映炎症反应的存在。两组数据在统计学上有相关性，证实了这些初步观察（图1e）。
接下来，为了分析自身抗体、临床病理参数和患者预后之间的关系，作者在一个更大的PF+病例群中测量了FGF8自身抗体，没有发现明显的关联，然而，当根据FGF8自身抗体的中位丰度来区分患者时，低滴度的自身抗体患者比高滴度的自身抗体患者的无事件生存率明显更差（图2a），3年无事件生存率为13%，而后者为45.8%。在这种情况下，两组的总生存率差异不显著（图2b）。多变量Cox回归分析证实了这些发现，因为诊断时的FGF8自身抗体在无事件生存方面具有预后作用，独立于任何其他评估的临床特征。值得注意的是，在高FGF8 IgG水平的患者中，EFS和OS相似，而在低FGF8 IgG的患者中，OS优于EFS，这是由于一些患者尽管发生复发，但却获得了疾病缓解。也就是说，5名诊断时患有局部疾病和1名转移性肿瘤的患者出现了复发（2名转移性复发，3名区域淋巴结复发，1名局部复发），但在治疗后达到完全缓解。所有这些人都从二线治疗中获益，包括一名在诊断后6个月后发生第二次远处转移的转移性患者。因此，FGF8自身抗体代表了疾病进展的替代标志物，而不是总体生存率。
02 - FGF8在PF+RMS细胞系中过度表达
为了证明ARMS患者更强的自身抗体反应性与肿瘤中更高的FGF8表达有关，作者首先测量了正常对照细胞（间充质干细胞、胎儿和成人骨骼肌细胞）的FGF8 mRNA水平。与正常肌肉和间质干细胞（CTR）、PF-胚胎性RMS（ERMS）、尤因肉瘤（EWS）、非霍奇金淋巴瘤（NHL）和各种来源的细胞系，包括白血病、肺癌和乳腺癌、骨肉瘤、滑膜肉瘤、神经母细胞瘤相比，FGF8在PF+ ARMS细胞系中过度表达（图3a）。FGF8b/e/f异构体也是如此，而FGF8a在所有细胞系中均一表达的。为了检查FGF8蛋白在RMS细胞中的表达，使用了PF+（RH30, ARMS）和PF-（RD, ERMS）细胞系。与RNA数据相对应，在RH30细胞中观察到更强的FGF8蛋白的细胞质染色，而RD细胞中的信号很弱且仅限于核周区域（图3b,c）。当评估细胞内和分泌的FGF8蛋白时，两个细胞系在血清48小时后的裂解液和培养基中的差异得到了证实（图3d,e）。
最后，由于FGF8属于更广泛的具有旁分泌和自分泌功能的生长因子家族，这里将表达分析扩展到其他FGF家族成员。与正常对照组相比，FGF8亚家族成员FGF17在PF+ RMS细胞系中也显著上调（图S3），但是差异远小于FGF8，同时在PF+和PF- RMS细胞系之间没有观察到。相比之下，FGF18是FGF8亚家族的第三个成员，也是一些最具侵袭性的成人上皮癌的预后标志物，在RMS细胞中完全没有表达。与PF-ERMS细胞相比，FGF7在PF+ARMS细胞中的表达也明显较高，但与正常细胞中的表达相似。相反的是FGF1和FGF2是两个重要的家族成员，在正常和病理情况下具有广泛的有丝分裂活性，在肿瘤细胞系中的表达与正常细胞一样多。
03 - FGF8诱导的信号传导在PF+RMS细胞中是活跃的
FGF8通过与质膜上的成纤维细胞生长因子受体（FGFR1-4）结合而发挥其作用，一些证据表明，异常表达的FGFRs在RMS肿瘤发生中起重要作用。为了探索FGF8下游的信号传导，作者首先测量了PF+和PF−RMS细胞系面板中的GFFR表达，至于FGF8，与PF- ERMS细胞相比，在PF+ ARMS细胞和大多数分析的非RMS细胞系中观察到显著的FGFR2和FGFR4蛋白表达（图4a和S4）。
当在正常生长培养条件下评估时，PF+ARMS细胞的基础FGFR4和FGFR2磷酸化也较高，表明这两种受体的激活更强（图4b）。通过向PF+ ARMS（RH4）和PF- ERMS（RD）细胞的培养液中添加外源性FGF8来研究了生长因子依赖性信号。正如预期的那样，FGF8诱导了成纤维细胞生长因子受体底物2（FRS2）的快速但短暂的激活，FRS2是负责受体信号转导的膜锚蛋白，而PF+ RH4细胞中ERK1/2激酶的磷酸化更为持久（图4c，左图）。在RD细胞中，没有观察到FRS2的治疗依赖性磷酸化，而在相同的实验条件下，磷酸化ERK1/2状态略有变化（图4c，右图）。细胞运动是一种生长因子诱导的机制，通过MAPK激活在癌细胞中发生，仅在PF + RH4细胞中受FGF8刺激，如在生长因子暴露后48小时进行的伤口愈合测定中观察到的那样（图4d）。然后在NVP-BGJ398（Infigratinib）存在或不存在的情况下评估剂量依赖性FGF8诱导的ERK1/2磷酸化。正如预期的那样，NVP-BGJ398在PF + RH4细胞中完全消除了ERK1 / 2磷酸化，而在PF−RD细胞中未观察到任何变化（图4e）。此外，当PF+ ARMS（RH30；RH4）和PF- ERMS细胞（RD，RH36）在NVP-BGJ398存在下生长时，药物敏感性与FGF8 mRNA表达水平密切相关，因为ARMS细胞系表现出极端的药物敏感性，而ERMS细胞完全不受影响（图4f）。
最后，为了确定FGF8相关的细胞信号在基因表达水平上的影响，作者测量了重组FGF8处理后时间依赖性的DUSP6、SPRY4、GDF15和ETV5的转录。结果显示除ETV5外，DUSP6、SPRY4、GDF15在PF+ RH4细胞中都被FGF8迅速上调，而在PF- RD中没有进一步诱导转录（图5a，b）。给予FGF8也增加了RH4细胞中纤溶酶原激活剂（PLAU）和基质金属肽酶-9（MMP9）的基因表达，这是几种癌症的入侵、转移和血管生成的两个重要基因（图5c）。
04 - FGF8在PF+RMS患者中的表达水平非常高
为了评估FGF8在RMS患者中的表达，作者收集了50个肿瘤活体组织，并通过qRT-PCR测量FGF8 mRNA。与上述报告的结果一致，FGF8在RMS肿瘤组织中过度表达（图6a），特别是在PF+的肿瘤中（图6b），PF+ARMS和PF-ERMS病例的石蜡包埋组织切片染色证实了这一点（图6c）。通过查询在线可访问的基因组数据库，与PF-RMS（图S5a）和其他以病理基因融合为特征的小儿软组织和骨肉瘤（图S5b）相比，证实PAX3/7-FOXO1携带的RMS中FGF8过度表达。这种差异在本研究一个小队列中得到了验证，其中包括脱髓鞘小圆细胞瘤（DSRCT）、骨肉瘤（OS）和尤文氏肉瘤（ES）（图5c），提供了FGF8是PF+ARMS的可靠肿瘤标记物的最终证据。除了FGF8与PAX3/7-FOXO1融合状态有关外，观察到10岁以上和1岁以下的患者与1至10岁的儿童相比，FGF8的水平也较高。诊断时有转移性疾病的患者（IRS第四组）的FGF8水平反而高于有局部疾病的患者（IRS第二、三组），但这种差异没有统计学意义。值得注意的是，将肿瘤组织中的FGF8表达与自身抗体滴度相匹配，发现这两个变量之间存在显著负相关（图6d）。当根据FGF8 IgG和mRNA中值（I至IV组）对患者进行分组时，那些高自身抗体滴度和低转录物水平的患者（图6d，IV组，左上角）比其他mRNA/自身抗体组合有明显更多的机会不出现不良事件，如复发或疾病进展（图6d）。
05 - FGF8在复发性RMS肿瘤中呈上调状态
最近，在融合阳性RMS的小鼠模型中，尽管有PAX3-FOXO1的诱导，但FGF8在复发肿瘤中仍保持高水平，并在没有致癌融合蛋白的情况下作为促进生长和生存的关键因子。然而，由于PAX3/7-FOXO1靶向治疗并不是用来治愈RMS患者的治疗方法，为了了解在小鼠中观察到的FGF8上调是否会引起更广泛的RMS耐药现象，作者在分析PAX-FOXO1表达动态的同时，还测量了其在匹配的原发肿瘤和复发中的表达情况。发现在复发的ARMS肿瘤中，与匹配的原发肿瘤相比，FGF8的表达进一步增加（图7a，左），同时存在不相关的PAX-FOXO1表达变化（图7a，右）。也就是说，虽然所有患者复发时的FGF8水平都增加了，但PAX-FOXO1 mRNA仅在两名患者中增加（ARMS_5和ARMS_6），在其他患者中减少（ARMS_2、ARMS_3和ARMS_7）或保持不变（ARMS_1和ARMS_4）。同样，在五名患者中，有两名患者的原发融合阴性ERMS肿瘤中FGF8的基线量非常低，在复发时有所增加（图7b；ERMS_1和ERMS_4），尽管差异没有统计学意义。最后，当固体和液体活检的匹配在诊断和复发时都是可行的，FGF8 mRNA和抗FGF8自身抗体水平的趋势显然是相反的。事实上，虽然前者在复发时增加，但后者却减少了，这进一步支持了之前报道的FGF8 mRNA和自身抗体的反相关关系（图6d），以及表达FGF8的RMS将受益于体液反应受损而进展和扩散的假设。
四、结论
本研究首次证明，高风险的PAX3/7-FOXO1融合阳性的ARMS患者带有循环的自身抗体，能够改善诊断时的风险分层。证明了致瘤性和血管生成性的FGF8生长因子是PF+ARMS诊断和治疗的一个新的抗原，正如诊断时出现的特异性抗FGF8自身抗体所提示的那样，被宿主免疫系统早期感知到。通过进行生存分析，显示FGF8自身抗体滴度可以准确预测高危ARMS患者的复发，尽管临床诊断为局部或转移性疾病。鉴于循环FGF8自身抗体的无创性和容易检测，这种方法可能有助于更准确地考虑具有明显类似肿瘤分期，但可能有不同结果的患者，确定预测复发和治疗失败的患者特定的免疫反应差异。
