本次推送是文献分享30的对应内容。

多聚腺苷酸化 (ployA) 是真核生物中一种重要的转录后调控机制，它调节 pre-mRNA的成熟。 

对于很多基因来说，该过程可以发生在多个位点，即产生不同长度的成熟mRNA，这被称为选择性多聚腺苷酸化(APA)。 

APA事件已经被证实在基因组中广泛存在，如超过70%的拟南芥基因被发现有大于1个的ployA位点。 

虽然在多数情况下APA并不会改变mRNA的蛋白编码区域，但却可能会破坏位于3'-UTRs区域中的重要顺式调控元件，最终导致mRNA稳定性、定位和翻译效率的改变。

Fig 1

基于poly(A)位点位置的不同，APA主要分为3大类（Fig 1）：

（1）编码区域APA[CR-APA（exon）]，指poly(A)位点位于编码区域，通常涉及可变剪接，会产生具有不同编码序列的mRNA异构体，因此会产生不同的蛋白；

（2）内含子APA[IPA，CR-APA（intron）]，指poly(A)位点位于内含子区域，会产生截断的编码区，因此可能会翻译缺失C端结构域且具有新功能的蛋白

（3）3'-UTRs-APA，是最常见的APA，该类APA会导致产生多种具有不同3'-UTRs长度的mRNA异构体，但同时并不影响蛋白编码序列。

Fig 2

文献分享30中，作者利用APAtrap软件（Fig 2）来检测APA事件，本次推送将介绍该软件的原理和操作。

APAtrap软件鉴定APA的原理

Fig 3

这个软件第一步先是检测3‘UTR（Fig 3），其实这个信息在我们研究的物种的基因组注释文件中是有的，但是一般的基因组注释是比较粗糙的，基因结构注释总会存在大量的问题，对于一般的分析可能影响不大，但是我们现在研究的是APA还是有很大影响的，所以这一步相当于是对基因组注释的校正。我们先是把基因组的注释文件输入进去，它会识别出已经注释的3‘UTR区，然后对这个区域上下延申10kb，然后从这个范围的开头以100bp为窗格、以1bp为步长，滑动检测这个范围的reads。比如这个图上，蓝色是基因组的注释情况，红色是校正后的情况，有可能是本来没有注释出3‘UTR，根据我们的转录组数据注释到了，有可能是之前的注释过长或者过短，最后整合这些情况得到修正好的3‘UTR。

Fig 4

第二步是在这个修正后的3‘UTR，将它的最末端称为“远端polyA位点”，然后对3‘UTR从5’端向3’端以100bp为窗格、以1bp为步长，滑动检测这个范围的reads，目的是检测覆盖深度显著下降的位置，这些位置被认定为潜在的ployA位点（Fig 4）。对于两个条件的比较，输入的是多个转录组数据，所以对这些所有的数据在100bp以内的polyA位点被合并，认定为一个ployA位点。需要注意这里检测到的APA位点是前面介绍的三种类型中最主要的一种，即3'-UTRs-APA

Fig 5

第三步是用来检测处理和对照是否存在差异APA的情况。

比如在给定的示意图中（Fig 5），有A和B两个样本，在A样本中根据深度的骤减鉴定到两个潜在的APA位点，它们的3‘UTR长度分别为L1和L2，在sampleB中也鉴定到两个潜在的APA，它们的3‘UTR长度分别为L3和L4，就长度而言，L1<l2<l3<l4< span="">，固定这个排序，然后表征出样本A和B在这4个APA的使用情况。然后作者计算了皮尔逊相关系数，该值为正表明B样本比A样本偏好更长的3‘UTR，为负说明A样本偏好更长的3‘UTR。

Fig 6

最后根据这两个指标来判定是否是差异表达的APA基因（Fig 6）。第一个是差异的百分比，作者在文章中建议的阈值是大于0.2，第二个是校正后的P值，小于0.05.

Fig 7

还有一个点需要注意，作者针对具有长3‘UTR的基因组和具有短3‘UTR的基因组提出了不同的建议参数。针对长3‘UTR基因组举的例子是人，用到了100bp的窗口大小和对参考基因组注释的3‘UTR左右延申10kb的检测范围，短3‘UTR基因组举的例子是水稻，用50bp的窗口和左右延申5kb.

软件实操

软件官方链接：

https://sourceforge.net/p/apatrap/wiki/User%20Manual/

01 鉴定3'UTR

Fig 8

-i  short reads mapping result in bedgraph/wig format, can accept single file or multiple files. 

-m  gene model file in bed format. 

-o  file store the information of extended 3'UTR in bed format.

输入数据准备：配置合适的基因组注释文件

Fig 9

02 鉴定APA

Fig10

-i  short reads mapping result in bedgraph/wig format, can accept single file or multiple files. 

-g  number of groups (treatments/conditions) of the input files, e.g. -g 2. 

-n  number of files(biological replicates) in each group (treatment/condition), e.g. -n 1 1. 

-u  3'UTR annotation file in bed format. 

-o  information of the predicted APA sites and their usage.

03 差异APA分析

Fig 11

输出结果

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