2020年10月7日，瑞典皇家科学院已决定将2020年诺贝尔化学奖授予德国马克斯·普朗克病原学研究所的Emmanuelle Charpentier博士以及美国加州大学伯克利分校的Jennifer A. Doudna博士，以表彰她们在基因组编辑领域的贡献。

两位科学家于2012年在《科学》杂志发表论文并首次指出，CRISPR-Cas9系统在体外实验中能“定点”对DNA进行切割，显著提升了基因编辑的效率。那么，除了CRISPR-Cas9，还有哪些CRISPR-Cas系统相关的基因编辑工具？

2020年6月来自哈佛大学与麻省理工学院Broad研究所的研究团队在《Nature Biotechnology》发表CRISPR-Cas基因编辑系统及其衍生工具的详尽综述。该综述将重点放在CRISPR技术上，旨在向读者概述当前CRISPR技术的能力和局限性，以便于工具选择，并突出未来改进的机会。

CRISPR-Cas基因编辑系统及其衍生工具

新的CRISPR-Cas基因组编辑工具的开发继续推动生命科学的重大进展，除最基本的Cas核酸酶外，单碱基编辑系统 （base editors）、Cas转座及重组酶系统和先导编辑器系统（prime editors）的出现让基因编辑有了更多选择。

CRISPR–Cas系统

在自然界中，CRISPR-Cas系统是细菌和古生菌的适应性免疫系统的一部分。由于CRISPR–Cas系统的可编程性，以及某些Cas效应器在各种细胞类型和生物体中的鲁棒性，使其在生命科学中得到广泛应用。

天然存在的CRISPR–Cas系统分为两大类：第1类，使用多蛋白复合物用于核酸切割；第2类，使用单蛋白效应域进行切割。由于单蛋白效应域提供的优势，第2类系统是用于生物学研究和翻译应用的最广泛的CRISPR工具。第2类进一步细分为II，V和VI三种类型，每种类型都使用不同类型的Cas蛋白。在来自第2类系统的Cas蛋白中，大多数II型Cas9突变体和V型Cas12突变体具有RNA引导的DNA内切核酸酶活性，而VI型Cas13突变体似乎显示出优先的RNA靶向和切割活性。研究团队主要讨论了Cas9和Cas12核酸酶。

Cas9：来自第2类CRISPR系统的Cas9效应子是RNA引导的内切核酸酶，可在目标DNA序列中产生DSB。自从化脓性链球菌（SpCas9）在体外和在哺乳动物细胞中通过Cas9核酸酶对DNA进行程序化切割的首次报道以来，研究人员已经发现了许多的Cas9突变体，并对其进行了基因组编辑测试，包括来自金黄色葡萄球菌、嗜热链球菌、脑膜炎奈瑟菌的同源序列，空肠弯曲菌和许多其他生物。

Cas12：Cas12核酸酶包含V型CRISPR系统的几种突变体。这些蛋白质仅具有单个RuvC样核酸酶结构域，可介导两条链的目标DNA切割。Cas12a（早期被命名为Cpf1）是最早被发现并广泛用于基因组编辑的Cas12核酸酶。

修复通路：细胞内存在多种DSB修复机制，DSB修复机制可分为两大类：对断裂的DNA末端进行重新连接（末端连接），通常在DSB位点附加核苷酸缺失或插入；以及使用DNA模板进行同源性定向修复（HDR）。CRISPR–Cas核酸酶最常用于有效和选择性地破坏靶基因序列。在大多数哺乳动物细胞中，核酸酶诱导的DSB最常通过易出错的末端连接过程进行修复。

Cas突变体的开发：

扩大基因组编辑剂的靶向范围一直是CRISPR–Cas技术开发的主要重点。目前大量的工作集中在扩大Cas9突变体的靶向范围，特别是SpCas9，但是识别富T-PAM序列的Cas12突变体的发现和工程化将可能继续扩大Cas效应器的靶向性。此外，研究团队注意到工程化Cas蛋白突变体的活性不如野生型蛋白，当Cas蛋白用于更高要求的应用，如编辑人类遗传疾病的动物模型或靶向被内源性蛋白质占据的DNA位点时，这种缺陷最为明显。因此，构建能够在访问某些具有挑战性的PAM序列时保持高活性的稳定Cas突变体仍然是未来发展的一个重要方向。

具有更高DNA特异性的工程化Cas突变体。Cas核酸酶的精确靶向取决于其将靶向序列与整个基因组中存在的类似脱靶序列区分开的能力。尽管在识别和工程设计更高保真度的Cas突变体方面已经取得了实质性进展，这些突变体可以在很大程度上减少脱靶编辑，但是对这些突变体的高通量评估表明，这类突变体的靶位点活性较低。此外，大多数高保真度的Cas9突变体都不能容忍标准化向导RNA的变化，包括5'G的添加或错配。这些因素限制了它们在实践中的实用性。因此，在降低脱靶活性的同时保持其有效的靶位点编辑活性，并保障系统与各类向导RNA突变体的兼容性，是未来优化的重要方向。

单碱基编辑系统

单碱基编辑系统可以在不需要诱导DSD或补充供体DNA模板的条件下精确地完成定点突变，并且该过程也不依赖HDR。目前已开发了两种主要的碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器（CBE），催化C-G碱基对转化为T-A碱基对；腺嘌呤碱基编辑器（ABE），可催化A-T到G-C的转化。CBE和ABE可有效介导四种碱基转换突变（C→T，A→G，T→C，G→A），这类突变约占当前已注释的人类病原体变异的30%。目前单碱基编辑器被广泛用于多种细胞系和模式生物中，包括人类遗传疾病的动物模型。

单碱基编辑系统使用的注意事项：目前单碱基编辑器的多样性增加了其成功应用的可能性，这也让合理选择适合的单碱基编辑器更具有挑战性。选择单碱基编辑器时需要考虑，PAM的可用性，核苷酸序列信息，编辑窗口，产物纯度和DNA特异性等。

当前的CBE和ABE能够在各种序列背景下以及在包括哺乳动物在内的各种细胞类型和生物体中，在整个基因组的目标基因座上进行精准的定点突变，特定条件下还可以进行靶位点的随机突变。目前，单细胞编辑器还需要在编辑效率、特异性和体内递送能力上做进一步优化，并且开发活性可控的单碱基编辑器或使用外源性小分子可进一步提升其作为研究工具和潜在疗法的实用性。

转座酶和重组酶系统

在活细胞中靶向整合的通用方法一直是基因组编辑领域的长期挑战。尽管核酸酶和切口酶介导的HDR可实现定向整合，但这些方法仅限于主动分裂细胞。近年来研究人员发现天然CRISPR相关转座酶和工程化Cas结构域融合转座酶系统可以在体外将基因组整合到细菌基因组中。

先导编辑器系统

先导编辑器系统是一种最新的基因组编辑技术，可以精确、有针对性地引入所有12种可能类型的点突变（即所有6种可能的碱基对转换），小插入和小缺失。主要的编辑器是Cas9切口酶域（灭活的HNH核酸酶）和工程逆转录酶域之间的融合蛋白。虽然先导编辑器的效果令人惊喜，但仍有许多待解决的问题，例如细胞状态/类型对编辑效率的影响，先导编辑过程中涉及的DNA修复机制等。同时探寻适用于先导编辑的小型逆转录酶对于其未来应用相当关键。

From 研究团队

基因组编辑技术的迅速发展将我们带入了一个新的时代，在这个时代我们可以编辑我们自己的基因组，以及影响许多其他有机体的基因组。我们正处在这个新时代的开端。继续努力提高编辑能力，了解编辑我们基因组的所有后果，创新将编辑剂注入细胞的新方法，并充分吸收科学家、医生、伦理学家，政府和其他利益相关者的意见将是指导我们下一步行动的关键和确保这些科学进步能够充分发挥其造福社会的潜力。

首发公号：国家基因库大数据平台

参考文献

Anzalone, A.V., Koblan, L.W. & Liu, D.R. Genome editing with CRISPR–Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol 38, 824–844 (2020). 

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