1. Author
2005年Kevin O.Saunders在戴维森学院获得生物学理学学士学位。博士期间，他在Karen Hales的实验室进行不孕不育基因相关研究。2010年Kevin O.Saunders博士于2010与杜克大学的Georgia Tomaras一起完成了针对HIV-1感染的CD8+T细胞免疫研究。2014年，KevinO.Saunders加入杜克大学人类疫苗研究所，担任医学讲师。在此期间，他分析了接种疫苗的猕猴的抗体反应，从而鉴定了疫苗接种诱导的聚糖依赖性HIV抗体。Kevin O.Saunders于2015年被任命为杜克大学人类疫苗研究所非终身制外科助理教授和蛋白质表达实验室主任。2018年，他成功过渡到终身制任命，随后于2020年晋升为外科副教授。他目前担任杜克大学人类疫苗研究所的研究主任。他撰写了书籍章节和许多期刊文章，并拥有疫苗设计和抗病毒抗体的专利。Kevin O.Saunders目前的致力于对抗HIV-1和冠状病毒感染的疫苗和抗体开发。
2. Background
2.1 抗体ADE效应
ADE效应。它的全称是Antigen-Dependent Enhancment，也就是抗体依赖的增强效应。经自然免疫或疫苗接种后，再次接触相关病毒时，体内产生的抗体可能会增强其感染能力，最终导致病情加重。1964年，澳大利亚科学家Royle Hawkes在一次实验中意外地发现，在高度稀释的鸡抗体血清的环境中，黄病毒科的多种病毒对鸡胚成纤维细胞的感染性增强。这一发现与“血清具有保护作用”的认识相矛盾，Hawkes对自己的发现产生了怀疑。
3年后，Hawkes终于证实，血清确实有可能增强病毒的感染性，并进一步发现，这一现象和血清中的IgG抗体有关。这是人类首次认识到病毒的抗体依赖性增强效应，但当时Hawkes并没能解释这一现象的具体机制。直到 1977年，登革热领域的先驱、著名病毒学家Scott Halstead才将登革热病毒（dengue virus，DENV）在临床上引起的重症登革热和ADE联系起来——部分感染者康复之后获得了对登革热病毒的免疫力，然而一段时间后，当这些患者第二次感染登革热病毒时，病情反而比第一次更严重。Halstead解释说：ADE是由白细胞表面的Fc受体（FcR）介导发生的。在抗体的Fab段识别和结合病毒后，抗体的Fc段与白细胞（包括单核巨噬细胞、B细胞、中性粒细胞等）表面的Fc受体相互作用，使病毒粘附于白细胞表面，促进了白细胞对病毒的内吞作用，增强了病毒的感染能力。这也是目前ADE发生的最主要机制。除了依赖于FcR之外，还有依赖于细胞表面Ⅲ型补体受体（CD3）。
2005年，研究人员在实验中首次发现，针对人SARS冠状病毒（SARS-CoV）的抗体可以增强另一种SARS毒株对宿主细胞的感染，并且在人B细胞和巨噬细胞中，SARS病毒的ADE效应与特定类型的Fc受体（FcγRII）相关，阻断这一受体可以阻断ADE的发生。另一项针对MERS冠状病毒（MERS-CoV）感染的ADE的体外研究发现，如果初次感染时诱导的抗体不够理想，也可能直接引发ADE效应。基于SARS 和MERS冠状病毒的证据以及临床研究，已有研究者合理推测，新型冠状病毒SARS-CoV-2感染也存在ADE效应。
2.2 Fc受体（FcR）的基本结构
FcR是一类能够和抗体Fc片段特异结合的细胞表面蛋白，不同类型的细胞可以表达不同类型的FcR，对应的不同结构类型的抗体也和不同类型的FcR结合，从而诱导后续的不同类型的免疫反应。每一个FcR包含一个位于细胞表面的和配体特异性结合的α链和其它负责将FcR蛋白转运到细胞表面，以及传递FcR信号的链（FcRγ）。FcRγ通常为二聚体结构，是一种跨膜蛋白，通过其跨膜结构和α链耦联，其胞内结构包含ITAM或者ITIM结构域，行使介导FcR信号通路的作用。
IgG类型抗体的Fc受体是FcγR，依据和Fc片段亲和力的强弱FcγR又可以被分为三个亚家族：FcγRI、FcγRII和FcγRIII；IgG1和IgG3能够有效的激活FcγR，对应的IgG2和IgG4激活FcγR的能力就较弱。
FcγRI的结构比较特殊，其胞外的α链中有三个串联的Ig结构，而其他的FcR的胞外架构一般有两个Ig结构。FcγRI主要在单核细胞、巨噬细胞和DC细胞上表达，在被IFNγ和G‐CSF激活后，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也会表达；FcγRI和IgG1和IgG3的结合力较强，可以介导免疫细胞抗体依赖的吞噬作用、ADCC等作用。
FcγRII（CD32）有三种形式，FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc；FcγRIIa主要在中性粒细胞、单核细胞、DC细胞表面表达；FcγRIIc 主要在单核巨噬细胞、中性粒细胞和NK细胞表面表达；FcγRIIb的结构较特殊，其胞内结构域串联了一个ITIM结构（见上图），介导的是免疫抑制信号，激活后会下调细胞的相应功能，除FcγRIIb外所有FcγR介导的都为免疫细胞的激活信号。FcγRIIb主要在髓系细胞和B细胞表面（是B细胞表面唯一的FcR），在B细胞功能的负调节中起到重要作用。
FcγRIII (CD16) 在体内有FcγRIIIa和FcγRIIIb两种亚型，和IgG的结合力分别为中度和低亲和力。FcγRIIIa几乎在所有白细胞中表达，主要负责NK细胞的ADCC作用和巨噬细胞对抗体-抗原免疫复合物的清除。FcγRIIIb主要在中性粒细胞中表达，可以刺激中性粒细胞超氧化物的释放。
FcRn（neonatal Fc receptor） FcRn的结构和MHC-I分子类似，可以介导IgG从母体通过胎盘传递给婴儿，也可以帮助母乳中的IgG通过哺乳婴儿小肠细胞。FcRn在成年人和小孩体内都能够起到增长IgG类型抗体的半衰期的作用，这一作用可以在抗体药物设计上得到应用。
3. Methods
1. qPCR
2. 亲和力测试
3. ELISA
4. 组织病理学与免疫组织化学(IHC)
5. 蛋白表达纯化
6. 流式细胞术
7. SPR（表面等离子共振）
8. 假病毒中和测试
9. 冷冻电镜
10. 亚基因组mRNA测定
4. Results
作者首先采集了SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的外周血与记忆细胞进行了抗议筛选，分别得到了44个靶向RBD的中和抗体、10个靶向NTD的中和抗体与5个非中和的NTD增强感染抗体。值得一提的是，这5个NTD靶向的增强感染抗体是ACE2依赖/FcRγ非依赖的抗体（DH1052-DH1056 ）。另一方面，这些RBD抗体与表达不同亚型的FcR细胞相互作用，参与作用的亚型主要是FcγRⅠ与FcγRⅡb。而NTD的相互作用则依赖ACE2受体（非FcR）。
抗体表位与功能总紧接着，作者利用负染技术从结构的角度进行了探索，发现①靶向于RBD的抗体（无论增强或者非增强），都是从平行于S蛋白的中心轴垂直接触，阻断了S蛋白与ACE2的结合。所以无法从RBD结合的表位和角度区分是否增强感染。然而NTD就不同，增强型与非增强型在亲和力有明显不同，且结构上结合域的空间朝向也截然相反。② 感染增强抗体与非增强抗体识别同一S蛋白原体（protomer）。
此外作者发现DH1052（感染增强型）与DH1041（中和型）抗体是从同一个病人样本种采集到的，所以提出了一个猜想：总抗体起增强还是中和作用取悦于各抗体的浓度。通过实验发现只有当感染增强抗体是中和抗体1000倍时才能体现增强的活性。
紧接着利用冷冻电镜解析了RBD与NTD靶向的抗体表位（DH1041/1043/1047—RBD、DH1052/1050.1—NTD）。得到了如下的信息：①DH1041参与结合的是重链的互补决定区，DH1042参与结合的是重轻链的互补决定区DH1046参与结合的是α2、α3、β2链，同时包括了HCDR2、HCDR3和LCDR1、LCDR3。②NTD靶向的抗体DH1050.1与DH1052冷冻电镜结果与之前负染结果一致，有中和活性的1050.1朝向细胞膜部分，增强活性的1052朝向细胞膜的相反方向。③DH1050.1起作用的是HCDR3且轻链几乎不起作用。DH1052起作用的是重轻链所有互补决定区。
当完成体外证明以后，作者团队利用小鼠和猕猴作为研究对象，进一步探究体内的情况。以体外感染增强的NTD靶向的DH1052研究为例，发现在体内实验中他并没有提高病毒的感染。当猕猴同时注入中和型NTD抗体1050.1与增强型抗体1052时，作者分别检测了诸多指标：病毒载量、肺部感染水平、E/N蛋白在肺部灌洗液与鼻拭子液的含量，发现二者或多或少的起着中和的作用，并没有像体外实验一样，有感染增强的表型。
当研究完NTD靶向的抗体情况后，作者团队把目光放到了RBD靶向的抗体上。以体外感染增强的RBD靶向的DH1041研究为例，采取预防与治疗两个策略进行了给药后发现了同NTD抗体一样的现象：体外增强的抗体在体内并没有促进感染的作用。
