1. Author
Ivelin S.Georgiev博士在杜克大学获得计算机科学博士学位。2009年，他加入了位于马里兰州贝塞斯达国家卫生研究院的疫苗研究中心（VRC）新成立的结构生物信息学部门直至2015年。Georgiev博士现在是Vanderbilt疫苗中心的一员，同时也是Vanderbilt病理学、微生物学和免疫学以及计算机科学的副教授。在免疫学，病毒学和计算机科学的交叉点上，Georgiev博士带领的团队能够更好地理解抗体和抗原之间的相互作用，设计可以诱导目标抗体特异性的免疫原，并优化抗体应用于临床。Georgiev实验室的研究工作利用计算的能力来增加我们对免疫学和病毒学基本问题的理解，并利用这种理解来开发对抗疾病的新方法。Georgiev实验室还研究基于结构的蛋白质设计方法应用于开发新的疫苗和候选抗体产品，这些产品可以用来有效对抗病毒。
2. Background
LIBRA-seq
传统的抗体发现平台包括杂交瘤技术、体外展示技术和转基因小鼠技术，其抗体序列发现周期都较长，3-6月的时间不等。对于流行性突发性疾病，我们期待的是快速发现抗体序列。那高通量单B细胞测序就进入到我们视野。单B细胞受体测序的筛选方法不需要杂交瘤或者组合显示，可以直接获得天然抗体库，快速发现抗体。虽然B细胞受体(B cell receptor，BCR)测序是免疫反应识别感染和疫苗接种的强力工具，但从BCR序列到抗原特异性获取的信息有限。为了克服这一难题，2020年美国Vanderbilt大学医学中心的Ian Setliff博士的团队公布了名为LIBRA-seq的技术。
LIBRA-seq的方法原理
1.抗原做荧光修饰和寡核苷酸修饰
通过生物素和链霉亲和素连上PE荧光染料；寡核苷酸链包括PCRhandle(链接抗原)、barcode序列和捕获序列(能和beads上的序列互补配对，被bead“捕获”)；
2.抗原抗体孵育
提取有免疫反应的患者的外周血单核细胞，并与不同的抗原混合孵育；
3.流式分选
在（1）中抗原已经标记上了荧光染料，这时那些和抗原发生免疫反应的B细胞在流式细胞仪会被分选出来；
4.单细胞分选
流式分选出来的混合液上10X
Genomics仪器进行单B细胞-抗原处理，形成一个个的油包水的微滴，每个微滴中有单个的B细胞，带有寡核苷酸修饰的抗原、带标签的凝胶微珠；
5.高通量测序
构建V(D)J文库和抗原文库：beads捕获RNA后反转录，用人抗体库引物设计特定PCR扩增所有V(D)J序列，构建V(D)J二代测序文库；beads捕获抗原上capture sequence，扩增加接头序列，构建抗原二代测序文库。也可同时构建转录组文库，做IgG、BCR轻链和重链mRNA表达水平间相关性分析。
6. LIBRA-seq评分
高评分的序列可能为高抗原特异性抗体；通过蛋白表达系统，得到目标抗体。
3. Methods
1. LIBRA-seq
2. 抗体表达纯化
3. ELISA
4. 甘露糖竞争
5. RTCA中和试验
6. 纳米荧光素酶中和试验
7. SPR（表面等离子共振）
8. Fc功能测定
9. 抗体预防-感染小鼠模型
4. Results
实验团队收集到了一名患者的外周血（PBMC）样品，并用6种新冠三聚体抗原（SARS-CoV-2 S、SARSCoV S、MERS-CoV S、MERS-CoV S1、HCoV-OC43 S和HCoV-HKU1 S）作为LIBRA-seq的初始抗原，收集抗体。通过对抗体的综合评分，将15个抗体作为潜在的研究对象。进行ELISA实验进一步剔除假阳性的抗体后，进一步缩小为6个抗体。
众所周知，病毒除了研究较多的S1的RBD以外，还有NTD等结构域。抗体有可能通过这种不同的结合域发挥抗病毒作用，所以实验团队接下来试图探究筛选得到的抗体在S蛋白上的不同结合表位。得到了很多有趣的结论：
① 72-1、72-2、72-3、72-4的结合位点为S2domain；72-6的结合位点为S1的NTD；72-12的结合位点是RBD，但72-12的结合是并不与人细胞表面的ACE2发生竞争关系。
② 通过竞争性ELISA发现，72-1、72-2、72-4更倾向于结合S2蛋白但是72-3在S2蛋白上呈现多表位的特点。
③ 这些抗体的结合皆不受N165A、N769A突变的影响或者甘露糖竞争的影响。
紧接着实验团队就抗体的功能进行了研究，因为我们知道在免疫学当中抗体可以通过不同的模式发挥作用，比如抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用（ADCP），以及补体依赖的细胞毒性作用（CDC）。在进行相关实验后得到如下结果：
① 在筛选得到的抗体都没有中和作用，但是都具有抗体介导的吞噬作用（ADCP），并且RBD反应抗体72-12的ADCP活性着实可观。
② 与S2蛋白结合的72-1、72-2、72-3、72-4四个抗体具有明显的ADCT
③ 没有任何一个抗体可以完成ADCC
上文提及，所有抗体都没有中和作用，实验团队于是开始研究候选抗体的预防作用。进行小鼠水平实验后发现其中两种抗体（46472-4和46472-12）能够降低肺出血评分，有着良好的预防功能。72-12所具有介导吞噬作用已被证明与非人类灵长类动物中SARS-CoV-2 DNA疫苗的保护作用有关，同时72-12并没有中和的能力，所以吞噬作用可能是他发挥的主要形式。72-4参与的胞啃作用目前研究较少，很多机制还不是很明确，但毋庸置疑的是这种多交叉抗体的发现为今后的疫苗开发提供了新思路。
