人肝细胞癌是一种高死亡率的原发性肝癌，也是全球范围最常见的恶性肿瘤之一。遗传、表观遗传改变和病毒感染是肝癌的主要诱发因素。由于复发和转移率高，肝细胞癌的死亡率较高。为了研究人肝细胞癌的免疫抑制机制，本文作者使用单细胞转录组测序技术，分析细胞间相互作用，剖析肿瘤的细胞异质性。
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文章题目：Single-cell RNA sequencing shows the immunosuppressive landscape and tumor heterogeneity of HBV-associated hepatocellular carcinoma.
中文题目：单细胞转录组揭示HBV相关肝细胞癌的免疫抑制谱和肿瘤异质性
发表时间：2021.06
期刊名称：Nature Communications
影响因子：14.911
实验平台：10x Genomics Chromium scRNA-seq
DOI：10.1038/s41467-021-24010-1
研究背景
人肝细胞癌（HCC）由复杂的肿瘤微环境 (TME) 组成，由细胞（肿瘤浸润免疫细胞和基质细胞）、化学成分（趋化因子）和物理成分（细胞外基质）组成。这些相互作用以支持 HCC 的发展并影响治疗反应。对HCC的传统研究主要针对大块肿瘤组织，缺少TME中单个细胞的精确信息，而单细胞测序则成为研究癌症的重要平台。关于HCC，使用单细胞测序研究的案例还很少，而且这些案例在揭示整体多方面状态和交互作用方面存在限制性。研究者近期对源自患者的HCC肿瘤异种抑制模型进行研究，确定了与干细胞相关的肿瘤细胞亚群。由于该模型的免疫受损背景和非人类物种的限制，本文对一组乙型肝炎病毒（HBV）相关的HCC临床样品进行单细胞转录组研究，从而更好的概括人HCC中实际发生的生物学过程。
研究内容
HBV相关的HCC患者的单细胞转录组图谱
研究者对8个人HCC患者的肿瘤组织解离并分选去除死细胞，随后进行单细胞转录组测序获得了34个细胞亚群。结果表明，恶性细胞与非恶性细胞聚集成不同的细胞亚群，来自不同病例的恶性细胞（肿瘤细胞）分布在不同的细胞簇中，而来自多个病例的非恶性细胞聚集在一起，说明肿瘤间异质性水平相对较高。计算细胞比例发现T细胞和巨噬细胞比例可能有负相关关系，并利用bulk-RNA测序结果和TCGA数据库进行验证，说明肿瘤相关巨噬细胞（TAM）的丰度可能用于预测肿瘤浸润性T细胞是否稀缺。
TAMs免疫抑制标志物表达及预后意义
TAMs中，LAIR1、HAVCR2（也称为 TIM3）、LGALS9 和 VSIR 富集表达，特异性强。研究者发现在不同细胞群中CD163（M2 巨噬细胞 marker）和LAIR1的富集模式最相似，结合TCGA数据库中的RNA-seq数据集检测到这两个基因的表达显著相关，因此研究者猜测TAM 的免疫抑制功能可能是通过 LAIR1 发挥的，LAIR1 在 M2 巨噬细胞中具有免疫抑制作用。生存分析表明这两个基因的高表达均与HCC患者较差的生存期显著相关，免疫荧光染色也能频繁观察到LAIR1和M2巨噬细胞重叠，LAIR1和CD163经常共表达。这些结果都支持M2 巨噬细胞中 LAIR1 富集表达的假设。
不同的肿瘤浸润免疫细胞亚群轨迹分析
为了确定TME中细胞状态的演变关系，研究者进行了多种肿瘤浸润免疫细胞的拟时间序列分析，包括CD8+T、CD4+T、Treg、NK和TAM。CD8+T 和NK细胞逐渐过渡到具有衰竭状态的亚群状态，Treg细胞向更具免疫抑制状态的方向改变，TAM则向更具有免疫异质性的M2巨噬细胞状态改变，CD4+T主要是Th1和Th2细胞类型。这些结果表明免疫细胞向更具耗竭性或免疫抑制性状态转变，并描绘了HCC肿瘤中的整体免疫抑制性细胞图谱。
免疫检查点的免疫抑制谱
研究者接下来确认了免疫检查点成分在肿瘤浸润免疫细胞和互补抗原呈递细胞（APC）中的表达情况。利用细胞间互作分析（如：T细胞和肿瘤细胞），评估不同共刺激和共抑制检查点在塑造HCC免疫抑制谱中的相对贡献。通过 TIGIT-NECTIN2 确定了一个突出的共抑制信号，而NECTIN2（PVRL2）是 PVR 基因家族中表达最高的基因。在研究者内部队列和TCGA队列中，与相应的非肿瘤肝脏相比，HCC 中的 NECTIN2 显著上调。此外，对一组HCC和一组与HCC或HBV无关的肝硬化患者进行IHC检测TIGIT 和 NECTIN2 表达。结果表明，这两个蛋白在HCC中表达显著相关，而与HCC或HBV无关肝硬化组中则没有相关性，这说明TIGIT-NECTIN2 轴可能是一种肿瘤逃避策略，而不是病毒逃避策略。与非肿瘤相比，肿瘤中NECTIN2表达显著上调， 说明NECTIN2过表达可能对构建 HCC 发展中的免疫抑制谱很重要。研究者还在Treg 细胞中检测到多种免疫抑制免疫检查点基因的大量表达。此外，虽然PD-1 (PDCD1) 和 PD-L1/L2 (CD274/PDCD1LG2) 之间的相互作用很小，但在 Treg 细胞和巨噬细胞中CTLA4-CD86 和 HAVCR2-LGALS9 轴的共抑制信号很大。
与 PVR/NECTIN2 连接后，TIGIT 充当 T 和 NK 细胞的抑制性受体。为了研究在 HCC 细胞上表达的 NECTIN2 是否会导致 T 细胞耗竭，研究者在小鼠HCC细胞系Hepa1-6中用Crisper-Cas9敲除系统构建了Nectin2稳定敲除 (KO) 细胞。将Hepa1-6和小鼠脾脏T细胞共培养发现，与独自培养的T细胞相比，共培养系统中小鼠 HCC 细胞的存在显著抑制了 CD4+或 CD8+T细胞的增殖，而Anti-Nectin2抗体在共培养系统中显著恢复 CD4+和 CD8+T细胞增殖能力。Nectin2敲除实验也证明该基因抑制了T细胞增殖。接下来，研究者在Tp53敲除和c-Myc过表达HCC小鼠构建了Nectin2敲除模型，发现敲除鼠的HCC肿瘤变小，多种T细胞免疫浸润增强，IHC结果检测到敲除模型中T细胞增加也进一步证实上述结果，且这些T细胞中的耗竭标志物表达量没有显著改变。这些结果证明NECTIN2可限制 HCC 中 T 细胞浸润和活性的功能。
HCC 肿瘤细胞的亚克隆异质性和谱系层次
研究者根据整体转录组学特征对HCC肿瘤细胞进行分层，并发现HCC肿瘤细胞主要按照不同病例分层聚类，说明个体间异质性比个体内更强。接下来，根据一组LCSC marker基因表达模式进行无监督聚类，将细胞分为不同的LCSC marker组。尽管病例个体与LCSC marker组状态存在一定的相关性，但同时表达EPCAM、ALDH1A1 和 CD24 的 LCSC marker组2的细胞聚集在一起并包含来自多个病例的 HCC 肿瘤细胞。它们可能代表一个分子上不同的肿瘤细胞亚群。此外，研究者为每个病例的HCC肿瘤细胞生成了全基因组CNV图谱，并根据CNV变异程度构建HCC肿瘤细胞的谱系层次，共获得9个CNV组，且RTK家族基因表达特征具有患者间的异质性。总体而言，这些发现表明个体病例的HCC肿瘤细胞基于全局转录组特征、LCSC marker、推断的CNV状态和RTK基因表达四个方面的相似性聚类在一起，从而证实肿瘤间异质性程度比肿瘤内更强。然而，每个HCC肿瘤中有主要和次要细胞亚克隆，说明肿瘤内异质性水平不可忽视，这可能会给传统通过精确定位主要亚克隆的分子靶向治疗带来困难。
主要结论
研究者利用单细胞转录组测序技术探究了一组HBV相关的HCC患者的免疫谱和肿瘤异质性，并发现肿瘤相关巨噬细胞抑制肿瘤T细胞浸润，TIGIT-NECTIN2 相互作用调节免疫抑制环境。免疫细胞向更具免疫抑制性和耗竭性的细胞状态转变体现了促进癌症发展的整体免疫细胞谱。此外，全局分子特征的异质性揭示了共存的肿瘤内和肿瘤间异质性，且肿瘤间异质性更明显。这种免疫抑制谱和细胞间相互作用的分析为设计有效的肝细胞癌免疫疗法提供了机制信息。
参考文献：
Ho, Daniel Wai-Hung et al. “Single-cell RNA sequencing shows the immunosuppressive landscape and tumor heterogeneity of HBV-associated hepatocellular carcinoma.” Nature communications vol. 12,1 3684. 17 Jun, 2021.
