题目：在人青春期时期，睾丸发育的动态的细胞转录图谱
期刊：Cell Stem Cell
Highlight：
1、描述了一个人青春期发育中的睾丸的单细胞转录图谱
2、在青春期不同阶段生殖细胞分化的发生
3、在青春期之前，找到了Leydig和myoid细胞共同的祖先
4、在睾酮抑制的情况下，支持细胞和生殖细胞成熟的部分逆转
summary：
人睾丸细胞在青春期阶段经历动态的发育和结构变化，包括体细胞的扩增和成熟以及精子发生的起始。为了描述这些过程，我们绘制并分析了来自四个青春期的男孩的10k个睾丸细胞的转录图谱，并将它们与婴儿期和成年时期做对比。在青春期，未分化的精原细胞继续扩展和分化，这发生在配子发生之前。值得注意的是，我们找到了Leydig和myoid细胞共同的青春期之前的祖先细胞，并找到了控制这个分化过程的候选因子。进一步的，pre-pubertal的支持细胞展示出两种不同的转录状态，它们在代谢模式上是不同的，在它们最终分化为相同的群体之前。睾酮在支持细胞成熟、抗菌肽分泌和精原细胞分化中的作用在睾酮抑制的转性个体的睾丸（transfemale）中得以分析。总之，我们制作的睾丸的转录图谱提供了多个视角去研究在雄性青春期中发生的多种改变及关键的因子协作。
introduction
人青春期在睾丸生理、睾丸体积增大及复杂的激素调控和分子修饰上经历重大改变，以此来完成体细胞增殖和成熟以及精子发生过程的起始。青春期起始于下丘脑垂体性腺轴的重激活，这相对于童年时的静默状态而言。这个荷尔蒙控制要求下丘脑释放促性腺激素释放激素（GnRH），这可以刺激促性腺激素、黄体素、卵泡刺激激素的释放，黄体素主要负责刺激间质细胞产生睾酮而乱跑刺激素可以刺激支持细胞支持精子发生过程。
之前我们对于任何灵长类动物的青春期的理解主要集中在生理层面，并在啮齿动物中使用分子和基因组学方法获得数据。然而，在人和啮齿动物的青春期激素调控和精子发生的起始中是存在差异的。在小鼠中，B型精原细胞起始于第8天，并发生同步的第一波精子发生过程，在这个过程中前精原细胞经历了分化和同步过程产生了自我更新和分化中的精原细胞两类，这促使了小鼠精子的第一轮产生在第35天。随后，自我分化的精原细胞，定植到niche中，正常的进行连续的精子发生过程。然而，人缺少第一波精子发生过程，并认为在青春期开始之前维持了精原细胞处于未分化的状态。
在人中，青春期典型地起始于出生后地10-13岁，然而，在初生睾丸中仍然可以看到部分管腔出现低水平的未完成的精子发生过程，尽管成熟的精子通常不会在10-11岁之前产生同时进入减数分裂的细胞也会在这个时期陆续发生凋亡。（我们把juvenile定义为在婴儿期之后完全成年的性成熟之前，大概在1-14岁）。形态上，pre-pubertal睾丸类似于出生后小鼠的睾丸，未分化的精原细胞都连接索状的支持细胞，此时缺少基底膜和管腔。在青春期，基底膜和管腔的形成产生了结构化的曲细精管，这个过程包括内皮细胞（负责基底膜的形成），间质细胞（对激素信号做出反应），支持细胞等细胞的协同发育，这些细胞也被称为睾丸的主要的niche组分。然而，我们对于这些过程的研究是有限的，并且很多停留在对于分子和基因组水平的描绘，包括人精原干细胞的维持和该过程在青春期时对于精子发生和进展等过程的响应。
单细胞技术提供了唯一而有力的工具来探索人睾丸发育过程，可以同时检验数千个细胞，并不需要对细胞进行筛选，这些数据可以代表整个睾丸组织。该方法获得的数据中空间信息的确实可以通过正交验证方法进行弥补，比如说通过固定的组织的特异性蛋白的共定位等。在这里，我们展示了来自4个初生男性的全部睾丸共10k个细胞的单细胞转录组，并与我们之前发表的新生儿（1岁）及成年个体（25岁）进行比较。我们的研究揭示了生殖干细胞的动态变化及复杂的体细胞niche的修饰。niche的某些改变，比如睾酮的产生，伴随着生殖细胞状态的改变，比如生殖细胞和niche的交流。为了探索睾酮在生殖细胞和niche发育和功能中的作用，我们分析了睾酮抑制的成年的transfemale的转录组数据，这揭示了睾酮在促进睾丸发育中的作用。同时，我们的数据集和比较分析提供了用于研究人青春期睾丸精原干细胞和niche发育的多个视角，也提供了多个数据资源(https://humantestisatlas.shinyapps.io/humantestisatlas1/)
结果
1、人出生睾丸的单细胞转录组
我们通过一种快速尸检程序收集了四名贡献者的完整睾丸，年龄为7、11、13、14岁，johnsen分数分别为3，4，4，7.与以前的观察一致，我们的组织学检验揭示了形态和组分的主要改变：在七岁的样本中，我们观察到睾丸缺少基底膜和管腔，结构类似于小鼠出生后的睾丸。而在11岁的时候，管状结构开始呈现，在13-14岁时，出现了定义上的基底膜和管腔。为了研究该发育过程中的分子机制，我们从睾丸组织中分离得到了单个细胞并使用10X平台进行了单细胞测序。对于每个贡献者，分别做了两个技术重复，产生了8个数据集。在获得的10k个细胞数据中，7675个细胞通过质量检查并用于下游分析。我们获得了200k read/cell，这可以获得1500-2000 gene/cell ，测序的饱和度为85%，技术重复之间的相关性达到0.95.
为了描述清楚器的发育过程并确保对其他时间点的比较分析，我们整合了之前发表的成年人和婴儿数据集，获得了13797个细胞的数据集。我们首先进行了tsne分析，获得的8个主要的簇随后会通过已知的marker进行注释。其中cluster1-3为生殖细胞，1为精原细胞（UTF1+,FGFR3+）,2为精母细胞（SYCP3+）。3为减数分裂后的精子细胞(PRM3+)。4-8代表异质性很高的支持细胞（4C4; SOX9+），间质细胞和肌样细胞（5，IGF1+ and/or ACTA2+）以及平滑肌细胞（6，NOTCH3+）和巨噬细胞（7，CD14+）和内皮细胞（8，VWF+）
2、人青春期中精原细胞扩增和分化的不同阶段‘
我们通过生殖细胞的结果得到了在青春期阶段生殖细胞组成的变化。通过特异性表达的marker和以前的一些结果，将其分为一下阶段：缓慢自我更新和未分化的精原细胞（对照stat0-1），该阶段表达UTF1和大部分不表达MKI67，分化中的精原细胞（stat2-4），该阶段表达KIT和MKI67，其中stat4时即将进入减数分裂的细胞因此缺失MKI67的表达，精母细胞，从STRA8阳性转化为GPR85阳性，精子细胞，体现为PRM3阳性。拟时间分析的结果也验证了上述分析结果。生殖细胞之后被提取出来检测了它们在青春期阶段睾丸中的相对比例。有趣的是，生殖细胞在1岁和7岁的样本中只有未分化的精原细胞的分布，在11岁的样本中，除了未分化的精原细胞，也出现了分化中的精原细胞和减数分裂的细胞。值得注意的是，在一岁和七岁的样本中，精原细胞占很少的比例，大概仅有全睾丸细胞的3%-4%，而在11岁的样本中，，比例提升到10——15%。这与精原细胞扩增过程发生在分化之前的事实相符。13岁的样本与11岁在细胞成分上很类似，只是减数分裂细胞的比重有所增加。最后，在14岁的样本中，其细胞成分与成年人的很类似，说明几近完成了精子发生过程
随后我们使用免疫荧光的方法验证了单细胞的结果（此处略）
3、支持细胞成熟的基因表达动态变化
我们随后探索了支持细胞在青春期的发育。根据之前的描述，7岁的样本（青春期前）对UTF1和SOX9的染色揭示了包含混合精原细胞和支持细胞的索状结构。在青春期开始时，支持细胞和精原细胞移动到基底膜上，曲细精管形成，这个过程的会持续到14岁。为了确定其中的机制，我们提取了支持细胞的单细胞类群用作分析。这里，我们注意到，成熟的支持细胞比10X系统推荐的细胞大小要大，因此，在高年龄段获取的支持细胞数目少。因此我们没有办法计算发育过程中支持细胞的比例变化。我们的分簇结果定义了两个大的支持细胞集。细胞周期分析发现，右边比较大的细胞集包含各个样本的细胞，，并呈现G1阶段的特征，左边主要包含1-7岁的细胞，并呈现不同的细胞周期阶段。有趣的是，monocle的结果也显示了1岁和7岁的支持细胞会被分成两个阶段，最终这两个阶段会共同产生成熟的支持细胞。两个分支分别为Immature1和2，简称im1，im2
我们观察到多个im1和成熟的支持细胞不同于im2的特征，比如说雄激素受体靶向的基因表达等（这些基因是一个已知的雄激素以来的基因集），高的线粒体转录和低的核糖体蛋白基因。对AR和SOX9进行免疫共染色证明了这些过程的发生的顺序性，随着发育的进程，AR会逐渐上调并共定位到支持细胞上。im2细胞有相反的性质并在GO中多富集到转录和核糖体功能的词条。他们多呈现出核糖体蛋白基因高的转录活性，线粒ATP酶和线粒体膜蛋白以及有很多进入G1期的细胞。总之，这两个未成熟的支持细胞阶段在代谢和线粒体功能，转录及细胞周期等方面有明显的不同。
支持细胞的成熟过程的拟时间分析和差异基因分析获得了1000个在成熟与未成熟阶段表达差异的基因。与预期的相符，与细胞因子，细胞形态和胞外基质相关的基因在支持细胞成熟过程中会表达上调。与抗微生物相关的天然免疫肽段基因的表达也上调，说明支持细胞在发育过程中保护睾丸免受感染。同时我们的荧光结果也验证了上述过程（略）总之，我们的数据描述了复杂的支持细胞的发育过程，包括形态生成、代谢和天然免疫。

4、间质细胞和内皮细胞的共同祖先
有趣的是，聚类分析将Leydig和myoid细胞归为一类。对这一类进行重聚类，发现11岁和更早期的样本的细胞有更相似的基因表达模式。然而，在13岁和成年人的样本中我们观察到明显的两类细胞的分割。拟时间分析也发现这两类细胞在分化上有共同的起源。因此这两个结果说明这两类细胞在青春期前可能来源于同一种祖先细胞。
我们随后做谱系特异性基因的分析，获得1000个差异基因，早期的祖先细胞主要表达与转录相关的基因，随着其进入myoid谱系，细胞因子和细胞黏附相关的基因开始表达，这与myoid 形成特殊的管状结构相符合。相反的，当其进入ledig谱系时，表达的基因主要与其分泌功能有关，这与这些细胞的固醇生成时相关的。免疫染色验证实验结果（略）
5、使用其他的睾丸样本的正交验证
为了证实我们的结果，我们进行了IHC在五个其他的成熟期睾丸中（1，2，4，11，14岁）
6、青春期调控睾丸发育的信号通路
为了探索germ-niche和niche-niche的互作关系，我们检验了信号分子的关系。我们观察到动态并具有细胞特异性的编码配体、抑制因子的基因以及多个靶向重要信号通路的基因，如RA、NOTCH\GDNF\FGF\WNT等（此处略，method中未介绍方法）
7、睾酮抑制的transfemale的睾丸单细胞模式
尽管之前及目前我们的研究已经证明AR和睾酮在睾丸发育过程中具有重要作用，其中的分子机制却鲜有报道。因此，为了更好的地定义睾酮在成年睾丸中地作用，我们对两名transfemale志愿者地睾丸做了单细胞转录组测序，这两人长期进行睾丸酮抑制治疗。第一个睾丸来自于50岁的一名transfemale，在睾丸去除前接受了19个月的spironolactone和雌二醇处理，第二个睾丸26岁，在睾丸去除前接受了16个月的上述处理。在上述两名患者中，组织学检验揭示了很多成年未处理和使用睾酮抑制处理的睾丸组织的差异，总体上，曲细精管结构被破坏，生殖细胞发育过程损伤。因此对上述两例做的单细胞测序， 对于Tf1，我们的两个技术重复都极为相似，最后获得2161个单细胞，对于Tf2，其中一个重复获得了比Tf1细胞数目的两倍还多的细胞数。对上述样本做了tsne和聚类分析以及寻找到差异基因。然而，我们注意到在两个样本中相关细胞的比例差别相当明显，这可能是由于供体的年龄和处理时间导致的。尽管如此，我们在两个样本中发现的共同点是，其有较少比例（Tf1）或几乎没有（Tf2）的分化中的精原细胞、精母细胞和精子，但是存在未分化的精原细胞，而且是较未处理组，其数目是相对较多的。为了验证单细胞的结果，我们做了免疫荧光，发现UTF1在处理组和未处理组中均有表达，而MKI67和SYCP3在处理组表达明显少于未处理组。有趣的是，使用SOX9对支持细胞染色发现其定位在处理组中出现明显的异常，这可能帮助理解为什么睾酮抑制可以影响支持细胞。
8、睾酮促进生殖细胞和支持细胞的体内发育
为了更好理解睾酮抑制对于睾丸细胞的影响，我们将两个睾酮抑制的志愿者样本和其他正常的六个样本放到一起分析，有趣的是，发现睾酮抑制样本的精原细胞与未处理的样本的精原细胞被分到同一个位置，说明它们并没有转化到新的阶段而是仍然停滞在该阶段。通过检测阶段性的marker发现在睾酮抑制的样本中未分化的精原细胞所占的比重比未处理的样本高。之后的tsne和聚类分析也发现睾酮抑制的样本中的未分化的精原细胞主要未state0和state1.首先，我们观察到state0和1阶段的细胞有明显的分界，其次是state0或1细胞（不同来源的）表达相似的对应阶段的marker。总之，这些结果显示睾酮可以影响state0和1精原细胞的转录模式。
另外，我们也比较了支持细胞的数据，发现，来自睾酮抑制样本的支持细胞与11岁和13岁样本的相似程度要高于与14岁样本的相似程度，进一步可以通过支持细胞的marker变化予以说明。因此，睾酮在成人中被抑制可能会导致支持细胞发育状态的部分反转，使其处于类似于青春期支持细胞的阶段。