导读：
影响因子： 13.44
PMID：32651212
期刊年卷：Sci Immunol 2020 07 10;549(49)
DOI：10.1126/sciimmunol.abd1554
导读： http://www.ebiotrade.com/newsf/2020-7/2020714172546874.htm
《科学免疫学》（Science Immunology）上发表的一篇论文中，韩国研究人员表示，他们使用10x Genomics scRNA-seq平台对来自四名健康捐献者，八名轻度或重度COVID患者的外周血单核细胞（PBMC）进行单细胞RNA测序-19，以及5名重度流感患者，以识别导致COVID-19严重进展的因素。
他们发现，与严重流感患者相比，COVID-19患者在PBMC的所有细胞类型中均表现出高炎症特征，尤其是TNF /IL-1β驱动的炎症反应的上调。他们还观察到在严重COVID-19患者的经典单核细胞中，I型IFN反应与TNF /IL-1β驱动的炎症共存，但在COVID-19较轻的患者中未观察到。有趣的是，研究人员还在重症流感患者中观察到了I型IFN驱动的炎症特征。
作为免疫学变化的特征，研究人员调查了疾病组与健康供体组相比，PBMC中免疫细胞的相对比例。与轻度COVID-19的有限变化不同，他们发现PBMC中跨多种细胞类型的流感和严重COVID-19都有显著变化。在严重的COVID-19中，他们发现经典单核细胞的比例显著增加，而树突状细胞（DC），非经典单核细胞，中间单核细胞，自然杀伤（NK）细胞，效应记忆（EM）样CD8 + T细胞和EM样CD4 + T细胞明显减少。在严重流感中，研究人员发现经典单核细胞的比例显著增加，而DC，非EM样CD4 + T细胞，EM样CD4 + T细胞，IgG + B细胞，
为了比较不同疾病之间的感染效果，研究人员随后根据与健康供体组相比相对基因表达变化进行了分级聚类。出乎意料的是，他们发现PBMC中的所有细胞类型都是按疾病组而不是按细胞类型聚集在一起的。进一步的分析表明，在COVID-19中，不管细胞类型如何，外周血免疫细胞都可能受到常见炎症介质的影响。此外，尽管COVID-19和流感病毒具有自己独特的转录特征，但严重的COVID-19和流感病毒在所有类型的单核细胞和DC中共享转录特征，可能反映了在严重流感病毒和严重COVID-19中固有免疫应答的共同机制。
研究人员接下来分析了三种类型的单核细胞簇，以发现COVID-19特异性亚簇。他们特别关注经典单核细胞，考虑到它们在炎症反应中的关键作用，并研究了流感和COVID-19之间差异表达的基因，以便在经典单核细胞中发现COVID-19特异性的转录特征。
他们发现，除了TNF /IL-1β反应基因外，COVID-19特异性基因还富含TNF /IL-1β反应基因，而流感特异性基因则富含IFN-I反应基因。与COVID-19相比，IFN-I反应在流感中占主导地位。出乎意料的是，他们还观察到严重的COVID-19除具有TNF /IL-1β炎症功能外，还具有IFN-I响应功能。
最后，研究人员使用从致命COVID-19患者的死后肺组织获得的大量RNA-seq数据验证了IFN-I反应和炎性特征。尽管分析仅限于两名患者，但他们突出显示了IFN-I反应和TNF /IL-1β-炎症反应。
“在当前的研究中，作者证明了严重的COVID-19的特征在于TNF /IL-1β的炎性特征以及IFN-I反应。在SARS-CoV感染的小鼠模型中，IFN-I反应的时机是决定感染结果的关键因素。”作者总结说。“延迟的IFN-I反应可导致病理性炎症，而早期的IFN-I反应可控制病毒复制。因此，作者提出了不仅针对炎症细胞因子（包括TNF，IL-1β和IL-6）的抗炎策略，还针对病理性对于严重COVID-19的患者，需要研究IFN-1的应答。”
COVID-19和流感的免疫分型突出了I型干扰素在严重COVID-19
摘要
尽管大多数严重的急性呼吸系统综合症冠状病毒2（SARS-CoV-2）感染的人都患有轻度的冠状病毒病2019（COVID-19），但一些患者患有严重的COVID-19，并伴有急性呼吸窘迫综合症和全身性炎症。为了确定驱动COVID-19严重进展的因素，作者使用从健康供体，轻度或重度COVID-19患者以及重度流感患者获得的外周血单核细胞（PBMC）进行了单细胞RNA测序。与严重流感相比，COVID-19患者在PBMC的所有细胞中均表现出高炎症特征，尤其是肿瘤坏死因子/白介素-1β（TNF /IL-1β）驱动的炎症反应上调。在来自严重COVID-19患者的经典单核细胞中，I型干扰素（IFN）反应与TNF /IL-1β驱动的炎症共存，在COVID-19较轻的患者中未见到。作者还记录了I型IFN驱动的严重流感患者的炎症特征。在此基础上，作者提出I型IFN反应在严重COVID-19的炎症加重中起关键作用。
介绍
目前，严重急性呼吸综合征冠状2（SARS-COV-2），这将导致冠状病毒病2019（COVID-19），是全球范围内传播（1，2）和世界卫生组织已宣布它大流行。截至2020年6月2日，全世界报告的确诊病例超过610万，死亡人数超过37.6万（3）。
SARS-CoV-2感染通常会导致大多数感染个体自发消退的轻度疾病进程（4）。然而，一些病人，特别是老年患者，出现严重COVID-19感染，需要重症监护机械通气（4，5）。在中国武汉，COVID-19的死亡率估计为1.4％（5）。尽管该发病率低于由其他人类病原体冠状病毒引起的严重急性呼吸道综合症（SARS）和中东呼吸综合症（6），但仍远高于流感，流感是需要住院和治疗的常见呼吸道病毒性疾病。重症监护室。
在严重的COVID-19病例中，已经观察到一种高炎症反应，也称为细胞因子风暴，并被怀疑会导致COVID-19的有害发展（7）。在严重的情况下，包括肿瘤坏死因子（TNF）和白介素6（IL-6）在内的促炎细胞因子的循环水平会增加（8）。基因表达分析还显示，在严重情况下，IL-1相关的促炎途径高度上调（9）。在SARS-CoV感染的小鼠模型中，延迟但相当大的I型干扰素（IFN-I）反应促进单核细胞-巨噬细胞的积累和促炎性细胞因子的产生，导致致命性肺炎，并伴有血管渗漏和病毒特异性T细胞反应受损（10）。
在COVID-19的患者中也观察到免疫功能障碍。在严重的情况下，T细胞的绝对数量减少（8，11），和T细胞表现出与抑制性受体（表达功能衰竭12，13）。然而，在致命的COVID-19病例中，也报道了CD38，人类白细胞抗原（HLA）–DR和细胞毒性分子上调所反映的T细胞过度活化（14）。重度COVID-19患者的免疫功能障碍可归因于促炎性细胞因子（15）。
在本研究中，作者使用外周血单核细胞（PBMC）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），以鉴定与严重COVID-19感染发展相关的因素。通过比较COVID-19和严重流感，作者报告了TNF /IL-1β驱动的炎症反应在PBMC中所有类型的细胞中在COVID-19中占主导地位，而各种IFN刺激基因（ISG）的上调在严重流感中表现突出。当作者比较轻度和重度COVID-19感染患者的免疫反应时，作者发现重度COVID-19的经典单核细胞除TNF /IL-1β驱动的炎症外，还表现出IFN-I驱动的特征。
结果
来自COVID-19和流行性感冒患者的PBMC单细胞转录组
PBMC收集自健康供体（n = 4），住院的严重流感患者（n = 5）和临床严重程度各不相同（包括严重，轻度和无症状）的COVID-19患者（n = 8）。在住院期间的不同时间从八名COVID-19患者中的三名（患者C3，C6和C7）中两次获得PBMC。根据全血采样当天评估的国家早期预警评分（NEWS；轻度<5，重度≥5），将COVID-19患者的PBMC标本分为重度或轻度COVID-19组（16）。在NEWS评分中，评估了呼吸频率，氧饱和度，氧气补充量，体温，收缩压，心率和意识（16）。无论是否需要NEWS评分，何时需要住院均定义为严重流感。在COVID-19出现之前，从2015年12月至2016年4月登记了重度流感患者。与轻度COVID-19组相比，重度COVID-19组在采血之日的淋巴细胞计数显著降低，血清C反应蛋白水平更高（图S1A）。对SARS-CoV-2的N，RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）和E基因进行了多重实时聚合酶链反应（PCR），两组之间所有三个基因的Ct值均无统计学差异（图S1B）。
人口统计学信息在表S1中提供了实验性的scRNA-seq批次，在表S2和S3中提供了临床数据。
使用10x Genomics scRNA-seq平台，作者以严格的高质量过滤数据后，在所有患者中共分析了59,572个细胞，平均每个细胞产生6900个唯一分子标识符（UMI），平均每个细胞检测1900个基因（表S4）。生物学复制品（同一组中的PBMC标本）的转录组图谱可高度重现（图S1C），从而确保了本研究中生成的scRNA-seq数据的高质量。
为了以特定细胞类型检查宿主的免疫反应，作者使用Seurat软件包对59,572个细胞进行了基于高度可变基因的t分布随机邻居嵌入（tSNE）（17），并确定了22个不受患者或实验偏见的不同簇批次的scRNA-seq（图1A和图S1D）。根据众所周知的标记基因和两个未分类的簇，将这些簇分配给13种不同的细胞类型（图1，B和C，以及表S5）。在下游分析，作者只集中在11种不同的免疫细胞类型，包括免疫球蛋白G -（IgG抗体-）B细胞，IgG的+ B细胞，效应记忆（EM）样CD4 +T细胞，非EM样CD4 + T细胞，非EM样CD8 + T细胞，非EM样CD8 + T细胞，自然杀伤（NK）细胞，经典单核细胞，中间单核细胞，非经典单核细胞和树突状细胞（DC）排除血小板，红细胞（RBC）和两个未分类的簇。由于缺乏重复，个体C8（无症状病例）也被排除在外。在分级聚类中，来自同一细胞类型的大多数转录组图谱倾向于聚在一起，然后是疾病组，这表明免疫细胞类型和疾病生物学而非技术伪像是可变免疫转录组的主要驱动力（图S1E） ）。
图1 来自COVID-19和流感患者的PBMC的单细胞转录组。
（A）来自健康捐献者（HD）的59,572个PBMC的tSNE预测（四个样本，17,590个细胞），
严重流感（FLU）患者（五个样本，10,519个细胞），
COVID-19患者（无症状：一个样本，4425个细胞） ；
轻度COVID-19：四个样本，共16,742个细胞；
重度COVID-19：六个样本，共10,296个细胞），以组信息进行着色。
（B）在tSNE图上的已知标记基因的标准化表达。
（C）tSNE图由带注释的细胞类型着色。
（D）除未分类的1，未分类的2，RBC和血小板以外的各组细胞类型的比例。颜色表示细胞类型信息。
（E）箱形图显示轻度COVID-19（n= 4），重度COVID-19（n = 6）和FLU（n = 5）与HD组相比（轻度COVID-19与HD：n = 16;重度COVID-19与HD：n = 24; FLU与高清：n = 20）。对于箱线图，该框表示四分位间距（IQR），而晶须对应于1.5×IQR内的最高和最低点。未分类1（每个细胞的UMI相对较高，并且存在多个标记基因），未分类2（B细胞样且核糖体蛋白基因的高表达），RBC和血小板被排除。对疾病和HD组之间的每种细胞类型进行了双面KS测试。* P <0.05，** P <0.01和*** P <0.001。
作为免疫学变化的特征，作者调查了疾病组与健康供体组相比PBMC中免疫细胞的相对比例（图1，D和E，以及图S1F）。与轻度COVID-19的有限变化不同，在PBMC中跨多种细胞类型的流感和严重COVID-19均观察到了显著变化。在严重的COVID-19中，经典单核细胞的比例显著增加，而DC，非经典单核细胞，中间单核细胞，NK细胞，EM样CD8 + T细胞和EM样CD4 + T细胞的比例显著下降（图1E） 。在严重流感中，经典单核细胞的比例显著增加，而DC，非EM样CD4 +T细胞，EM样CD4 + T细胞，IgG + B细胞和IgG - B细胞显著减少。作者通过流式细胞仪分析验证了来自scRNA-seq的免疫细胞亚群的比例。来自scRNA-seq的总淋巴细胞，B细胞，CD4 + T细胞，CD8 + T细胞，NK细胞和总单核细胞的相对比例与流式细胞仪分析的相对比例显著相关（图S1G）。
与COVID-19相关的转录签名
为了比较不同疾病之间感染的影响，作者基于相对于健康供体组的相对基因表达变化进行了分层聚类。出乎意料的是，PBMC中的所有类型的细胞都根据疾病组而不是细胞类型聚集在一起（图2A）。基于K的可变基因的进一步研究-均值聚类支持PBMC中所有类型细胞上COVID-19特异性上调或下调的基因表达模式（图S2A）。这些结果表明，在COVID-19中，不管细胞类型如何，外周血免疫细胞都可能受到常见炎症介质的影响。尽管在COVID-19和流感之间有明显的转录特征，但严重的COVID-19和流感在所有类型的单核细胞和DC中共享转录特征（图2A中的黑框区域），这可能反映了在严重的流感和严重的COVID-19先天性先天免疫应答中潜在的共同机制。
图2 COVID-19的免疫情况。
（A）在细胞类型分辨率中使用疾病之间的标准化转录组的PCC进行分层聚类（n = 33）。热图的颜色强度指示PCC值。热图上方的颜色条指示细胞类型和疾病组。黑框表示严重COVID-19和FLU组之间高度相关的细胞类型。
（B）在COVID-19和FLU患者中DEG的选择GO生物学途径（n = 49）的富集P值的图示（左，六列：与HD相比，COVID-19和FLU组的DEGs;右，两个列：COVID-19和FLU组之间的DEG）。MHC，主要组织相容性复合体。
（C）tSNE图代表GBP1（FLU特异性），CREM（COVID-19特异性）和CCL3（COVID-19 / FLU常见）的代表性基因表达模式。
（D）上图：使用属于（B）中选定生物学途径的基因的COVID-19和FLU组之间的相对归一化基因表达，通过WGCNA分析得到树状图（n = 316）。下图：COVID-19和FLU组之间相对标准化基因表达的热图。彩色条（左）表示基于PCC的基于相对标准化基因表达的层次聚类所聚类的细胞类型信息。
WGCNA的模块化基因表达模式一起显示（G1，n = 10； G2，n= 147; G3，n = 27；G4，n = 17；G5，n = 12；G6，n = 64；G7，n = 34；G8，n = 5）。
接下来，作者试图根据基因本体论（GO）生物途径确定疾病特异性上调或下调基因中的相关生物学功能。首先，作者将轻度和重度COVID-19合并为一个COVID-19组，并使用基于模型的单细胞转录组学（MAST）分析与健康供体组相比，鉴定了每种细胞类型的疾病特异性基因变化（18）。NFKB1，NFKB2，IRF1，和CXCR3被特异性上调在COVID-19，和CXCL10，STAT1，TLR4，和II类HLA基因和免疫蛋白酶亚基特别是在流感（表S6）上调。坏死因子，TGFB1，IL1B和IFNG通常被上调。当作者直接比较COVID-19和流感时，在COVID-19中NFKB1，NFKB2和TNF上调，而在流感中STAT1，TLR4和免疫蛋白酶亚基的基因上调。对于每组差异表达基因（DEG），作者确定了前10个富集的GO生物学途径，并收集它们以证明每组DEG中的P值富集（图2B）。）。炎症反应基因在COVID-19和流感中均具有高活性，从而鉴定出独特和常见的生物学功能，但转录因子（包括炎症因子（即NFKB1 / 2和STAT4））的基因在COVID中上调-19。相反，与流感相比，在COVID-19中观察到与IFN-1和IFN-II信号传导途径，T细胞受体途径以及适应性免疫应答相关的基因响应有限。在流感，CREM中特异性上调的GBP1（IFN-γ介导的信号通路）以单细胞分辨率为例，说明了这种疾病特异性基因表达模式（转录的阳性调节）在COVID-19中被特异性上调，而CCL3（炎症反应）通常在上调（图2C和表S7）。
通过对与图2B相关的基因进行加权基因相关网络分析（WGCNA）（19），作者以特定于细胞类型的方式扩展了作者的分析。作者确定了几种模块化的表达模式（图2D和表S8）。在COVID-19组中，NFKB1 / 2，JUN和TNF在CD8 + T和NK细胞（图2D中的G6和G7 ）中被模块化，而IL1B，NFKBID和OSM在所有类型的单核细胞和DC中被模块化。 （图2D中的G3 ）。在流感组中，GBP1，TAP1，STAT1，IFITM3，OAS1，IRF3和IFNG在所有类型的T细胞和NK细胞（图2D中的G2 ）中被模块化，而CXCL10和TLR4在所有类型的单核细胞和DC中被模块化（G5和G6的一部分图2D）。一致地，COVID-19和流感之间的DEG在CD8 + T细胞和所有类型的单核细胞中占主导地位（图S2B）。
CD8 + T细胞在COVID-19和流感中的不同亚群
为了揭示CD8 + T细胞中疾病特异性的转录特征，作者使用Seurat对EM样和非EM样CD8 + T细胞簇进行了亚群分析（17）。在非EM样CD8 + T细胞簇中鉴定出与其他两个组相比，每个疾病组专门富集的亚类（图3A）。在非EM样CD8 + T细胞簇的六个亚簇中，簇1和簇3分别显著富集了流感和COVID-19组（图3，B和C，以及图S3A）。PPBP高表达的簇在随后的分析中排除了血小板的标志物，即血小板的标志物（例如，图S3A中的簇6）。聚类1和聚类3中上调的基因分别与先前定义的“甲型流感病毒感染”和“ SARS-CoV感染”的基因集相关（图S3B）（20）。作者还发现，簇3特异性上调的基因反映了免疫应答的激活，包括CD27，RGS1，CCL5，SELL和RGS10（图S3C和表S9）。根据STRING v11（21）在每个簇中选择的前30个上调基因的蛋白质相互作用网络分析揭示了PRF1，GNLY，群集1中的GZMB和GZMH以及群集3中的GZMK，GZMA，CXCR3和CCL5上调（图3D，绿色）。STAT1，TAP1，PSMB9，和PSME2，这是通过IFN-γ优先上调，过表达仅在流感特异性簇1（图3D，蓝色）。作者通过细胞内的颗粒酶B染色和佛波12-肉豆蔻酸13-乙酸盐（PMA）/离子霉素刺激的细胞内细胞因子对IFN-γ的染色验证了这些数据。CD8中颗粒酶B +和IFN-γ +细胞的百分比流感组的+ T细胞显著高于COVID-19组（图S3D）。在促炎和IFN反应的7种代表性GO生物学途径中，对IFN-I和IFN-II的反应途径与流感特异性簇1相关性更高，而对TNF或IL-1β的反应途径在流感中更为突出。特定于COVID-19的群集3（图3E）。
图3. CD8 ****+**** T细胞的亚群分析。
（A）所有组中非EM样CD8 + T细胞亚群的tSNE图（左，n = 6253），COVID-19（右上，n = 2653），FLU（右中，n = 1452），和HD（右下角，n = 2148）由群集信息着色。
（B和C）方框图显示了每个组中非EM样CD8 + T细胞簇中各个亚簇的比例（COVID-19，n = 10； FLU，n = 5； HD，n = 4）。比例遵循Shapiro-Wilk正态性检验所检验的正态分布，但COVID-19组中第3类的比例（P = 0.04）。簇1和簇3分别在FLU和COVID-19组中高度富集。群集1中COVID-19和FLU之间的双面Welch t检验P值为4.4×10 -3，群集1中FLU和HD供体之间的双边Welch t检验P值为3.5×10 -2，COVID-19和FLU之间为8.6×10 -3聚类3，以及聚类3中COVID-19和HD之间的5.8×10 -3。* P <0.05和** P <0.01。
（D）使用聚类1（左）和聚类3（右）的前30个上调基因进行STRING分析。
（E）条形图显示富集P簇1或簇3特异性上调基因中8种典型的促炎和干扰素GO生物学途径的值（簇1，n = 66；簇3，n = 183）。
COVID-19中经典单核细胞的转录特征
作者对所有三种类型的单核细胞簇进行了亚簇分析，以发现COVID-19特异的亚簇。但是，没有特定于COVID-19的富集子簇（图S4，A和B）。接下来，作者进一步关注经典单核细胞，考虑其在炎症反应中的关键作用。作者研究了流行性感冒和COVID-19之间的DEG，以寻找经典单核细胞中COVID-19特异性的转录特征（图4A）。TNF和IL1B是炎症反应的主要基因，分别被鉴定为COVID-19特异性基因和通常被上调的基因。为了更好地表征经典单核细胞的转录特征，作者进行了K-与健康供体组相比，至少一个疾病组中上调基因的平均聚类。作者确定了五个不同的上调簇（图4B和表S10）：簇1中的基因在所有疾病组中通常都被上调，簇2是流感特异性的，簇3与轻度/重度COVID-19相关，聚类4与流感和严重的COVID-19相关，聚类5与严重的COVID-19相关。
图4. COVID-19患者经典单核细胞的转录组。
（A）与HD相比，COVID-19和FLU中DEG的维恩图。
（B）K均值表示所有对FLU，轻度COVID-19和重度COVID-19之间的DEG聚类（n = 499）。颜色表示疾病和HD之间的相对基因表达。
（C）条形图显示了富集分析中的平均-log 10（P值）值，使用L1000 LINCS中列出的四个不同细胞系的扰动基因对簇2（C2，左）和簇3（C3）上调的基因。误差线表示SD。
（D）比较了C2和C3之间I型IFN应答（左； GSE26104）和TNF应答（右； GSE2638和GSE2639）的基因集的组合富集得分。** P＜0.01。每个点表示一个人。
（E）条形图显示了富集分析中的平均-log 10（P值）值，使用在L1000 LINCS中四个不同细胞系列出的扰动基因，对簇4（C4，左）和簇5（ C5，对）。误差线表示SD（C和E）。
作者使用来自每个细胞因子处理过的细胞的细胞因子反应性基因组，通过基因集富集分析（GSEA）检查了每个簇特异性基因（Enrichr中的LINCS L1000配体扰动分析）（22）。TNF /IL-1β反应性基因富集于COVID-19特异性簇3基因，而TNF /IL-1β反应性基因则富含IFN-I响应基因使流感特异性簇2基因富集（图4C），表明与COVID-19相比，IFN-I反应在流感中占主导地位。作者通过分析源自其他来源的细胞因子反应性基因组的簇特异性基因，证实了这一结果（图4D）。出乎意料的是，除了TNF /IL-1β反应性基因外，第4和第5个簇还显示出与IFN-I反应性基因的强相关性（图4E），这表明严重的COVID-19除了具有IFN-I反应性特征外TNF /IL-1β-炎症特征。
在严重COVID-19中，除了TNF /IL-1β炎症反应外，IFN-I反应
接下来，作者直接比较了轻度和重度COVID-19之间的经典单核细胞。当作者分析DEG时，严重COVID-19的特征是包括ISG15，IFITM1/2/3和ISG20在内的各种ISG的上调（图5A）。TNF /IL-1β反应性基因和IFN-I反应性基因均富含严重COVID-19特异性上调的基因（图5B））。作者在COVID-19的较大人群中测量了TNF，IL-1β，IL-6，IFN-β，IFN-γ和IL-18的血浆浓度。在这些细胞因子中，重度COVID-19的IL-6和IL-18与轻度COVID-19相比显著增加，而两组之间其他细胞因子的血浆浓度没有差异（图S5A）。这些结果表明，由于细胞因子的重叠作用，不能用几种细胞因子简单地解释细胞因子反应性基因签名。
**图5. ** 经典单核细胞的轨迹分析
（A）火山图显示了轻度和重度COVID-19组之间的DEG。每个点表示单个基因，当一个基因具有显著的DEG时用红色标记。
（B）柱状图，显示了使用严重1000 COVID-19组中上调的基因在L1000 LINCS中列出的四种不同细胞系的干扰基因在富集分析中的平均-log 10（P值）值。误差线表示SD。
（C）在单个COVID-19患者中在两个不同时间点获得的标本中经典单核细胞的轨迹分析（轻度：C7-2，1,197个细胞；重度：C7-1，631个细胞）。颜色表示群集信息（左）或COVID-19的严重性（右）。
（D）沿着伪时间绘制轨迹分析中代表性基因的相对表达模式。颜色表示由Monocle 2计算的相对基因表达。
（E）条形图显示了富集分析中的平均-log 10（P值）值，使用L1000 LINCS中四种不同细胞系的扰动基因进行了上调基因的表达。聚类3（左）和聚类1（右）。误差线表示SD。
（F）比较系统性红斑狼疮（SLE）（n = 16）和类风湿性关节炎（RA）（n = 5）的基因组在第3组和第1组之间的综合富集得分。*** P <0.001；ns，不重要。
（G）Park等人在第3类（左）和第1类（右）中对单核细胞衍生的巨噬细胞的1类基因模块上调基因的GSEA 。（24）。NES，标准化富集得分。
为了进一步研究严重COVID-19的特征，作者使用两个内部控制良好的标本（一个严重而一个轻度）对Monocle 2（23）进行了轨迹分析，其中两个PBMC样本均从单个患者（个体C7）和COVID-19。轨迹分析使经典单核细胞沿着疾病严重性与分别对应于较晚和较早的伪时间的聚类1和聚类3对齐（图5C）。簇1中的代表性基因在严重阶段富集，并且与IFN-I和TNF /IL-1β相关的炎症反应高度相关（图5D）， 图。S5B和表S11）。GSEA证实，IFN-I应答和TNF /IL-1β炎性应答在簇1中均显著，而在簇3中则不明显（图5E）。聚类1与来自系统性红斑狼疮的基因组相比具有显著更高的关联，系统性红斑狼疮是具有IFN-I特征的代表性炎性疾病，比聚类3更显著（图5F，左），但与类风湿关节炎的基因组没有显著相关（图5F，右）。
通过分析对IFN-I无反应但与TNF诱导的对TLR刺激的耐受性相关的基因模块，作者获得了严重COVID-19中IFN-I增强的TNF炎症反应的其他证据。Park等。（24）先前证明TNF耐受单核细胞中TLR诱导的基因表达，尽管TNF本身是炎症细胞因子。他们还表明，IFN-I通过消除TNF的耐受性效应诱导高炎症反应，并将负责IFN-I增强的TNF-核因子κB（NF-κB）炎症反应的基因模块定义为“ 1类”（24）。该基因模块在簇1中显著富集，但在簇3中却没有富集（图5G）。），这表明IFN-I反应可能会通过消除负面反馈机制来加剧炎症过度。
致命病例中肺组织中高炎症特征与IFN-I反应的结合
最后，作者使用从致命COVID-19患者的死后肺组织获得的大量RNA-seq数据验证了IFN-I反应和炎性特征（25）。尽管分析仅限于两名没有单个细胞类型分辨率的患者，但在基因组浏览器中，死后COVID-19肺组织和经典单核细胞中普遍观察到IFITM1，ISG15和JAK3的上调以及RPS18的下调。严重的COVID-19（图6A）。在细胞因子反应基因组的分析中，肺组织中IFN-I反应和TNF /IL-1β-炎症反应均显著（图6B））。肺组织中的DEG与簇4显著相关，簇4在流感和严重COVID-19中通常上调，而簇5在图4B中对特异COVID-19具有特异性（图6C）。这些基因也与轨迹分析中鉴定的聚类1显著相关，但与聚类3不相关（图6D）。当基因组由轻度和重度COVID-19之间的DEG定义时，死后肺组织中的DEG与在重度COVID-19中特异上调的基因显著相关（图6E）。
图6： 来自致命COVID-19的死后肺组织转录组中组合的IFN-I和炎症反应的验证。
（A）UCSC基因组浏览器代表基因的图片。
（B）条形图显示了使用L1000 LINCS中四种不同细胞系的扰动基因进行的富集分析的平均值-log 10（P值）值，与活检健康人相比，死后肺组织中的上调基因（n = 386）肺组织。误差线表示SD。
（C）死后肺组织中基因集的显著上调和下调基因的GSEA来自C2（n = 96），C3（n = 143），C4（n = 218）和C5的上调基因图4B的（n＝ 30）。
（D和E）GSEA的死后肺组织用于基因组显著上调和下调的基因起源于簇3中的顶部200上调基因（左）和在轨迹分析簇1（右）图5C（ D）和基因集源自轻度（左）和重度（右）COVID-19（E）的经典单核细胞中前200个上调的基因。
严重的COVID-19已被证明是由炎症反应引起的（7）。特别是，经典单核细胞和巨噬细胞分泌的炎性细胞因子被认为在COVID-19的严重进展中起着至关重要的作用（26）。在目前的研究中，作者证实了先前研究的结果，尽管TNF /IL-1β炎性反应在COVID-19中占主导地位，尽管有少数患者入选。但是，作者还发现，严重的COVID-19除TNF /IL-1β反应外还伴有IFN-I反应。这些结果表明，在严重的COVID-19进展中，IFN-I反应可能通过增强TNF /IL-1β驱动的炎症来促进炎症反应。
数据上传至 GEO GSE149689.
参考：
1.导读： http://www.ebiotrade.com/newsf/2020-7/2020714172546874.htm
2.Immunophenotyping of COVID-19 and influenza highlights the role of type I interferons in development of severe COVID-19.
