操作步骤:请自行准备:无水乙醇、异丙醇、1.5mL 离心管,生理盐水。
1取出洗涤液,按 70%比例加入无水乙醇, 9mL加入 21mL无水乙醇,18mL加入 42mL无水乙醇,混匀。
2.样本处理:A. 组织样本:取 10-20mg 左右的组织,用液氮研磨为粉末,转入 1.5mL离心管内,加入 100 μL生理盐水,振荡 15秒 (或直接在 100μL生理盐水中将组织匀浆为细胞悬液);B. 细胞样本:取 1.5mL离心管,直接加入 200μL细胞样本。
3.加入 200μL裂解液, 20μL复合消化液,充分混匀,65℃温育 12分钟(如组织匀浆不充分,可适当延长消化时间至组织完全消化, 对于毛囊等难消化组织,可将消化时间延长至 1-2小时)。如需除去 RNA,可在加入裂解液后先加入 20μLBIOGDNase –Free RNaseA(货号:51006),振荡混匀,室温放置 5分钟。再加入 20μL消化液,振荡混匀,65℃水浴 12分钟。
4.加入 400μL异丙醇,轻轻颠倒混匀,如有半透明悬浮物,不影响 DNA的提取与后续实验。
5.将吸附柱放入收集管内,将上述溶液转入吸附柱内,12,000 rpm离心 1分钟,弃收集管内废液。
6.按每份样本 40μL取洗脱液(如 10份提取样本,即取 400μL洗脱液),放置于灭菌 1.5mL离心管,65℃预热。
7.将吸附柱放回收集管内,加 500μL洗涤液至吸附柱内,静置 2分钟,12,000rpm离心 1 分钟,弃收集管内废液。
8.将吸附柱放回收集管内,加 500μL洗涤液至吸附柱内,12,000rpm离心 1 分钟,弃收集管内废液。
9.将吸附柱放回收集管内,12,000rpm离心 2分钟,离去残留的洗涤液。
10.取出吸附柱,放入新的 1.5mL离心管内,加入 40μL上述预热的洗脱液,静置 2分钟,12,000rpm 离心 1分钟,收集 DNA溶液。提取的DNA即可用于下一步实验或-20℃保存。
注意事项:
1.组织在提取前应匀浆充分,如无法充分匀浆,应延长消化时间至组织完全消化,直至肉眼无可见的组织块 。
2.使用本试剂盒,动物组织取样量不要超过 25mg,细胞量建议不高于 10^7。
3.洗涤液在使用前应加入乙醇后充分混匀,最好现用现配,每次根据所要提取的样本量计算后适量配制。