再生是组织修复的关键，但皮肤损伤通常会产生纤维化的、无功能的疤痕。开发促进再生的疗法需要严格了解从损伤到纤维化或再生的分子进展。在此，研究者在转录（单细胞RNA测序）、蛋白质（TIMSTOF蛋白质组学）和组织（细胞外基质超微结构分析）水平上对瘢痕与YAP抑制诱导的伤口再生进行分析。结果显示，破坏YAP的机械传导，可以通过激活Trps1和Wnt信号的成纤维细胞产生再生修复。他们也通过体内基因敲除和在伤口中过表达进行验证，确定Trps1是一个关键的调节基因。该研究的发现作为伤口再生的多组学图谱，对病理性纤维化有治疗性意义。
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文章详情
文章题目：Multi-omic analysis reveals divergent molecular events in scarring and regenerative wound healing
中文题目：多组学分析揭示了疤痕和再生伤口愈合过程中不同的分子事件
见刊时间：2022.02
期刊名称：Cell Stem Cell
影响因子：25.269
实验平台：scRNA-seq (10X Genomics)、蛋白质组学（TIMSTOF）
DOI：10.1016/j.stem.2021.12.011
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研究内容
1、纤维性和再生性伤口的多模式分析
由于损伤修复包括多个阶段，因此随着时间的推移，研究愈合的细胞和分子动力学是至关重要的。研究者在7个时间点分析了小鼠伤口和小鼠皮肤：UW皮肤，术后第一天(POD) 2(炎症)，POD 7(成纤维细胞增殖)，POD 10，POD 14(伤口重新上皮化，成纤维细胞产生ECM)，POD 21和POD 30(成纤维细胞重塑ECM)。研究者使用了夹板切除伤口模型，从而诱导类似人类的愈合动力学。伤后立即在创面上注射维替泊芬或载药(磷酸盐缓冲生理盐水[PBS])对照。对照组创面形成明显的纤维疤痕，基本上是裸露的区域，有致密的、线性排列的ECM纤维，没有次生元素(HF，腺体)；相反，到POD 30时，维他泊芬处理的伤口再生的HF和腺体水平与UW皮肤相当，并有更低密度、更随机定向的ECM纤维(图1A)。证实再生不反映维替泊芬的脱靶效应，通过En-1成纤维细胞系靶向YAP敲除观察到类似的表型。
为了研究再生和纤维化伤口的细胞和分子动力学，研究者从5个关键时间点(UW、POD 2、7、14和30)分别损伤并分析5只小鼠(2个伤口池/只老鼠)和治疗条件(对照组，维替泊芬;图1 B)。每只小鼠三分之一的组织用于组织学检查，其余进行细胞分类，以分离成纤维细胞(Lin−)和其他细胞(主要是免疫细胞;Lin+)。一半的细胞进行蛋白质组学分析:从每只小鼠的Lin -和Lin+细胞中纯化的多肽进行timsTOF质谱。其余细胞进行scRNA-seq，每个样本都带有标签寡核苷酸(HTO)，使scRNA-seq细胞与来自同一只小鼠的蛋白质组学和组织学样本相连接。
研究者通过scRNA-seq共分析了2,986个细胞，并对细胞进行了聚类 (图1C)。结果显示，维替泊芬治疗的伤口成纤维细胞适度增加，但对照组和维替泊芬伤口的细胞比例大体相似(图1D)，这表明维替泊芬可能通过改变细胞表型而不是相对表现(或通过改变细胞类型中亚群的表现)来诱导再生。随后研究者做了timsTOF 4D蛋白组学分析 (图1E)，并表明蛋白组分析可以在更广泛的修复动态中捕获连贯的纤维化变化。最后，由于ECM结构/组织是物理组织特性的关键决定因素，他们使用新开发的图像处理算法对损伤皮肤和UW皮肤的ECM超微结构进行了量化(图1F上)。结果表明，随着时间的推移，对照伤口的ECM与UW的ECM显著不同(图1F左下)，证明了纤维化瘢痕。相比之下，POD 14/30维替泊芬伤口与UW皮肤重叠(图1F，右下)，表明维替泊芬治疗后的愈合产生了UW样ECM。无论是哪种处理，POD 7-14之间的差异最大，这与ECM沉积主要发生在这段时间一致。
2、识别修复的分子轨迹
在建立了通过scRNA-seq、蛋白质组学和ECM超微结构分析分析伤口动力学的能力后，研究者试图应用这些方法来确定再生和纤维化的不同机制。由于成纤维细胞是高度机械敏感性的，也是瘢痕形成的主要驱动因素，他们假设维替泊芬通过改变成纤维细胞表型来促进再生，并将scRNA-seq分析聚焦于成纤维细胞。他们做了细胞轨迹分析 (图2A)。由此产生的轨迹有两个分叉的分支，早期(POD 2)损伤的成纤维细胞靠近分支点，晚期损伤的成纤维细胞位于分支末端(图2B第一张图)，UW皮肤成纤维细胞几乎只存在于底部分支(图2B第二组)。他们假设下臂代表了再生修复轨迹，成纤维细胞向UW样状态进展，而上臂(富含PBS/缺乏UW皮肤成纤维细胞)是一个相对纤维化的轨迹。值得注意的是，在再生臂中发现了一些PBS创面成纤维细胞(图2B第二组)，突出说明再生和纤维化可能在细胞上并不相互排斥;具有促再生活性的细胞可能存在于疤痕伤口中，但在缺乏干预(例如，YAP抑制)的情况下，促纤维化分子编程可能会覆盖这一点，并导致主要的疤痕表型。
接下来,他们试图识别出可再生成纤维细胞和再生成纤维细胞轨迹的明显特征。louvainbase(Seurat)聚类识别出6个成纤维细胞集群：集群0和4组成“再生”臂；1、2、5组成“纤维性”臂；3个主要包括UW皮肤成纤维细胞(图2B最后一个面板和3A)。研究者沿着感兴趣的主要轨迹计算每个基因的拟时序皮尔森相关性(图2B第三组)。纤维化臂(簇1、2和5)富含已知的促纤维化标志物，如Dpp4、Fap和Gpx3(图2C和3B)。纤维细胞型轨迹细胞也表达了更多的Fgf2、Il6、Ccl2、Myc和Tead1，其在成纤维细胞中的上调且与焦粘附激酶(FAK)-介导的器官纤维化和肿瘤基质沉积有关。GSEA分析显示在基因的前1%与拟时序呈正相关,揭示了ECM沉积,生长因子，机械化以及与纤维相关的应激物(MAPK)/ Ras信号和焦点粘附(图2D和3D)，支持经典的亲纤维性表型。
他们接下来研究了与拟时序强负相关的基因，并发现了多种发展- /再生相关的基因(图2F和3C),包括Bmp4类似的与再生损伤反应有关的基因。他们还确定了几个参与Wnt信号的基因，包括Wnt靶标Axin2和Twist1；Wnt通路调控因子Trps1，其与HF形态发生有关。通过对与拟时序负相关的前1%基因进行GSEA分析，再生臂的骨形态发生蛋白(BMP)和Wnt相关条目富集；被富集到的条目也包括多个与Wnt相关的条目和“调节干细胞多能性的信号通路”(图2G和3E)。接下来，他们使用SCENIC平台比较基于基因调控网络的轨迹 (图2I)。Trps1、Gli1和Twist1调控子在再生臂中被更多激活(图2J)，进一步支持Wnt激活。他们还做了基于CellChat方法的细胞互作分析 (图4A和4B)。CellChat强调了增强的促炎症信号(例如:,CXCL和IL6)在再生臂中涉及瘢痕(PBS)成纤维细胞和非标准Wnt信号(图4C-4E)。
接下来，他们又做了RNA速率分析。结果显示，纤维化臂和再生臂的RNA速率方向相反，纤维化臂中的载体指向增加的POD，而再生臂中的载体指向更早的时间点细胞(图2K)。他们还应用了CytoTRACE。结果显示，UW皮肤成纤维细胞分化程度最高(CytoTRACE评分较低)，而伤口成纤维细胞分化程度相对较低(评分较高;图2 L)。纤维臂成纤维细胞总体上分化较少，随着POD的增加分化增加(分数降低)，而再生臂细胞沿轨迹分化减少，表明随着愈合的进展，发育潜力增加。接下来，他们分别分析了组成每个轨迹的聚类，并检测了与每个分支的CytoTRACE评分最相关的基因。在纤维力臂中，随着时间的推移，分数的减少很大程度上是由与ECM相关的基因(图3F上)驱动的,与成熟的瘢痕成纤维细胞的命运相一致。另一方面，在再生臂中随着时间的推移，在再生臂上的分数增加(图3F下)，与HF和ECM再生一致，在治疗后最突出(POD 14/30，图1)。总的来说，CytoTRACE在RNA速度分析上支持相反的细胞轨迹，并独立支持纤维化与再生臂表型。
3、多模态数据集成分析伤口修复轨迹
为了跨平台分析，他们首先尝试将成纤维细胞(Lin−)蛋白质组数据与scRNA-seq数据广泛关联起来。纤维臂中富集的蛋白质的GSEA显示了与生长因子信号、机械信号、收缩性和ECM沉积/组织和ECM成分(胶原、腓纤维蛋白[Fbln1]和纤维连接蛋白[Fn1]；图2 E) 强相关的条目富集。相比之下，再生臂缺乏机械信号、收缩力或ECM相关条目，与scRNA-seq一致(图2H)。接下来，他们将scRNA-seq数据与ECM结构和HF/gland计数的变化相关联结果显示，簇5细胞高表达Dpp4、Il6和Ccl2，是瘢痕成纤维细胞的特征(图3B)。
研究者在进行多模式分析之后确定了Trps1在再生中的功能意义，但具体如何确定的呢？请见下回详解……
