最近大家不知道怎么样了，看到了疫情结束的曙光了，北京租个房子真的贵，劝退能力太强了，o(∩_∩)o 。这一篇分享单细胞空间联合分析的知识，关于损伤后的毛囊再生，文章在Spatial anchor of adaptive immune cell around biomaterials mediated large-scale wound regeneration ,看看单细胞空间联合分析带来的分析内容
Abstract
一般来说，成年哺乳动物的严重伤口只能再生很少的HF（毛囊），这仅限于大伤口中心，称为伤口诱导的毛囊新生（WIHN）。 整合空间转录组 (ST) 和单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 的基因表达谱突出了适应性免疫细胞在大伤口中心与 HF 前体细胞共定位的优先聚集。 此外，观察到无论伤口大小如何，伤口都通过植入细胞外基质 (ECM) 支架重现了正常的皮肤结构。 适应性免疫细胞在biomaterials周围的分布扩大，与 HF 前体细胞重叠，可能是biomaterials植入伤口中 WIHN 增强的原因。 在 Rag2-/- 小鼠中丧失 WIHN 的能力验证了操纵适应性免疫系统对无疤痕伤口再生的潜在治疗效果。
Introduction
没有皮肤附属物的大面积纤维化瘢痕严重影响患者的日常生活，是伤口愈合的主要障碍之一。 ECM 支架是严重伤口的有效治疗方法之一，但仍缺乏刺激 HF 新生的能力。有趣的是，在 WIHN 模型中，在大型伤口中心观察到了罕见的 HF 再生能力。有人提出，免疫细胞（主要是巨噬细胞、T 细胞）可能是选择性促进瘢痕形成或再生 WIHN 的伤口愈合的关键协调者，而免疫系统的空间异质性仍不清楚。之前的研究表明，ECM 支架能够增强 HF 的再生以及免疫调节作用。然而，由生物材料引发的异物反应（FBR）和对皮肤细胞的特异性免疫调节作用仍然难以捉摸。在这项研究中，首先在大面积（直径 = 1.5cm）夹板切除伤口愈合模型中重复了 WIHN 现象，其标志是伤口中心的从头 HF 再生。接下来展示了 ECM 支架对增强的 WIHN 发挥了进一步的促再生作用，无论伤口大小。包括 scRNA-seq 和 ST 在内的多组学方法被用于描述伤口愈合过程中免疫微环境的微妙空间特征。综合分析强调了 T 细胞、单核细胞和促炎巨噬细胞 (PIM) 与支架周围的 HF 前体细胞共定位的优先聚集。它们之间丰富的局部细胞间通讯表明适应性免疫系统在 HF 再生中具有治疗潜力。缺乏 HF 再生能力的 Rag2-/- 小鼠提供了进一步的证据，证明生物材料激活的适应性免疫系统对于无疤痕伤口愈合至关重要。
WIHN occurred in large wound center with activation of adaptive immune system
在小鼠切除伤口愈合模型中创建了小面积和大面积（直径从 0.6 厘米到 1.5 厘米）圆形伤口。比较不同伤口大小的新生HF数，证实WIHN发生在大伤口（直径=1.5cm）中心，而小伤口（直径<1.5cm）愈合，具有无真皮附件的纤维化瘢痕特征。为了探索刺激WIHN的潜在机制，分别创建了不同伤口大小的Ctrl_SW（直径=0.6cm）和Ctrl_LW（直径=1.5cm）组，并采集伤口组织进行进一步检查。与小伤口相比，大伤口显示出富含毛囊发育和αβT细胞分化的基因表达上调。相关热图显示HF再生相关基因与适应性免疫反应相关基因之间呈正相关。免疫荧光 (IF) 染色和流式细胞术证实大伤口（尤其是伤口中心）保持大量的适应性 T 细胞浸润。
Integration of spatial transcriptomics and scRNA-seq profiling
为了探索伤口愈合过程中单细胞的空间特征，应用 ST 和 scRNA-seq 来分析大小伤口的空间基因表达谱。基于ST剖面，可以清楚地区分伤口的解剖结构。基因富集分析表明，Ctrl_LW样本上调了与毛囊形态发生和抗原呈递相关的基因。成纤维细胞亚群的异质性可以解释为什么小伤口通常会在没有 HF 的瘢痕下愈合的原因。根据之前的报道，小伤口真皮修复的主要初始波是由下层成纤维细胞介导的，包括 LF (49.88%) 和 RF (21.93%)，这与皮下组织和真皮中的胶原蛋白沉积有关。相比之下，大伤口有更多的上谱系PF（36.11％）。 PF 由 2 个subclusters组成，包括 PF1 (Runx1+Inhba+) 和 PF2 (Notch1+Prdm1+)，它们都被认为具有支持 HF 启动的能力。来自 scRNA-seq 的成纤维细胞特征基因在空间分布表明，PF（HF 相关）在大伤口中心内表现出强烈的空间偏好。为了探索不同的免疫细胞类型如何有助于愈合过程，接下来评估了免疫细胞亚群的异质性。 Ctrl_LW组的单核细胞(Mono)、抗炎巨噬细胞(AIM)和促炎巨噬细胞(PIM)较多。如图 2G 所示，Mono、PIM 和 AIM 弥散分布在小伤口中，而 Mono（与抗原呈递有关）和 PIM（与促炎途径有关）显示出在大伤口中心优先聚集。此外，Ctrl_LW组显示出更高比例的适应性T细胞。几乎所有的 T 细胞亚群都只在大伤口中心表达。相比之下，小伤口似乎缺乏可观察到的T细胞浸润。综上所述，在大伤口中观察到PF（与HF再生有关）以及适应性T细胞、Mono和PIM的优先聚集，这为它们之间潜在的细胞通信奠定了基础。
Cellular communication landscape between immune cell and HF-related cutaneous cell
接下来，为了解决定义的细胞亚群之间的潜在相互作用，应用细胞通讯来预测配体/受体表达水平的细胞间通讯模式。通过比较相互作用强度（信息流），可以确定不同生物条件下信号通路的减少（关闭）或增加（开启）。选择了上调的通路并比较了表现出不同信号模式的配体受体的整体信号强度。包括 MHC-I、MHC-II 和 CD80 在内的适应性免疫系统相关通路仅在大伤口中富集。大伤口中免疫细胞和皮肤细胞之间的主要信号传导是由PF介导的（与HF再生有关）。如图 3D 所示，适应性免疫细胞和毛囊前体细胞富含相互作用的配体或受体基因伴侣，例如 Il6/Il6st、Inhba/Acvr1b。空间图显示 Il6 和 Inhba 在大伤口中优先聚集。已经报道了激活素和 Il6 途径在 HF 再生中的重要作用。研究结果表明，免疫细胞，尤其是 T 细胞、Mono 和 PIM 可能通过 IL-6 和激活素等信号通路调节 PF、毛囊祖细胞 (HFP) 和毛囊干细胞 (HFSC) 的状态。
Enhanced WIHN occurred in scaffold-implanted wound with the further activation of adaptive immune system
合成移植是治疗严重大面积皮肤创面的有效方法之一，尤其是在患者donor不合格的情况下。随着对组织工程的深入了解，建议合成生物材料模仿天然ECM结构的天然结构可以整合并发挥潜在的促进伤口愈合的作用。之前的报告已经说明了 ECM 支架在小伤口（直径=0.6cm）愈合中的免疫调节作用。接下来在有/没有植入生物材料的 C57BL/6 小鼠中重复大型全层伤口愈合模型，以研究是否在 ECM 支架处理的伤口中观察到进一步的再生现象。图 4A 总结了评估大伤口愈合的工作流程。在ECM_LW组的全层切除伤口（直径，1.5 cm）下方放置了ECM支架，而Ctrl_LW组不接受任何材料。 ECM_LW 组的伤口覆盖更快，并且 ECM_LW 的间隙宽度也更小。细胞角蛋白5（Krt5）和细胞角蛋白10（Krt10）的IF染色显示生物材料周围有角化细胞，ECM_LW组新上皮面积更大。如图 4F 所示，植入大伤口的 ECM 膜没有触发明显的纤维包膜。该支架在体内具有快速的降解速率。分析可以观察到POD 14上的降解碎片和POD21上的降解颗粒，POD28上没有任何可见的残留物。此外，在 ECM_LW 组中可以识别出 HF 形态发生的轮廓：在 POD7 上首次出现在毛胚阶段，它们逐渐长成球茎-钉状结构，覆盖在 POD21 上的降解支架碎片上。在 POD28 上，发现 ECM_LW 组重现了正常皮肤结构，具有相同数量的成熟附件和“篮波”ECM 胶原蛋白沉积。总之，在小鼠大型全层伤口模型中，生物材料导致伤口愈合更快并增强了 HF 的再生。膜优异的生物相容性和可降解性也避免了进一步临床应用中免疫排斥和二次手术的风险。为了探索潜在的机制，注意到 ECM_LW 组显示出与毛囊发育和 T 细胞分化有关的基因富集增加。 IF & IHC 染色和流式细胞术证实植入的生物材料周围的 T 细胞浸润增加。
Integration of ST and scRNA-seq illustrated the cell heterogeneity around biomaterials
为了探索支架植入伤口中细胞异质性的空间特征，还应用 ST 和 scRNA-seq 来分析空间基因表达谱。解剖结构也可以在 ST 切片中识别，ECM_LW 显示毛囊形态发生中的基因富集以及适应性免疫反应。基于 scRNA-seq 分析，ECM_LW 组显示出更高比例的 HF 相关成纤维细胞和角质形成细胞。空间特征图显示了植入的生物材料周围的角质形成细胞。此外，观察到 ECM_LW 组上谱系 PF（与 HF 再生有关）的分布扩大。相比之下，包括 RF 和 LF（与胶原沉积相关）在内的较低谱系成纤维细胞显著减少，这表明不同的愈合结果。虽然通常在未植入的大伤口（POD14~21）伤口闭合后几天才开始HF形成过程。在 POD7 上 ECM_LW 组的 ST 分析中，我们可以识别出由新表皮中的 Krt28+HFP 和真皮下方的 Twis2+ Dermal condensate (Dc) 聚集组成的 HF 的初始结构，这突出了 ECM_LW 组中的早期 HF 形成特征。空间基因表达水平。为了探索支架诱导的免疫微环境，我们接下来将免疫细胞的标记基因与 ST 分析相结合。 ST 截面中每个簇的空间图如图 5H 和 5I 所示。分析注意到膜周围的 MAC 明显聚集。 T细胞在biom周围的扩大分布。值得注意的是，观察到组织驻留 ILC 在上皮以及肉芽组织中的积累，特别是在 ECM_LW 组中。上皮附近的 ILC 可能增强与 HFSC 或 HFP 细胞的细胞通讯，从而有助于 HF 的形成。基于多模态分析，仍然观察到 T 细胞、PIM 和 Mono 与 ECM_LW 组中的 HF 前体细胞的重叠分布，这暗示了它们之间潜在的细胞通信。
Prediction of critical signaling patterns between spatially colocalized cell populations of ECM_LW and Ctrl_LW
接下来，还应用 Cell Chat 来预测 EMC_LW 和 Ctrl_LW 之间的细胞间通信模式。热图显示了Ctrl_LW和ECM_LW组配体受体的整体信号强度。包括MHC-II在内的适应性免疫系统相关通路在ECM_LW中被激活。除 IL6 外，在 ECM_LW 组中，FGF、Notch、KIT 等胚胎 HF 发育中的关键信号也上调。值得注意的是，T 细胞亚群（尤其是 ILC）和 HF 前体细胞富含相互作用的受体/配体基因pairs，包括 Areg-（Egfr+Erbb2）、Epgn-Egfr。已预测 Egf 通路在胚胎性皮肤形态中的关键功能，并且认为表皮生长因子受体 (Egfr) 的表达对于 Treg 细胞促进皮肤伤口愈合至关重要。根据我们的分析，T 细胞（尤其是 ILC）可能通过 EGF 和 EGPN 途径调节 HF 前体细胞的生长，从而促进 HF 的形成。此外，如图 6E 所示，我们观察到免疫细胞（巨噬细胞和 T 细胞亚群）和 HF 前体细胞富含相互作用的受体或配体基因伴侣，包括 Mdk-（Sdc1 或 Itgb1）、Ptn-（Itgb1 或 Sdc1） .强调多效素（PTN）和中期因子（MK）通路在小鼠表皮分层事件中的作用发生在E13.5和E14.5之间。根据我们的预测，HF前体细胞可以通过区域细胞通讯反向介导免疫细胞的激活例如 Mk 和 Ptn 通路。为了证明适应性免疫系统在 HF 再生中的作用，我们将 ECM 支架放置在缺乏成熟淋巴细胞的免疫缺陷 C57Bl/6 (B6.129-Rag2tm1) 小鼠的背侧皮肤大伤口中。我们注意到 Rag2-/- 小鼠 (Rag2-/-) 的伤口闭合率延迟。 Rag2 - / - 小鼠中HF的再生很少。与募集 Cd3+ T 细胞的 WT 小鼠相比，在 Rag2-/- 小鼠中观察到 Ly6g+ 中性粒细胞。
Biomaterials facilitated the de novo HF regeneration despite of wound size
为了检测用生物材料治疗的小伤口和大伤口之间的伤口愈合是否仍有差异，接下来重复了植入生物材料的小（直径=0.6cm）和大（直径=1.5cm）全层伤口。与 ECM_LW 组一致，植入小伤口的对齐膜也没有触发明显的 FBR 纤维囊。小伤口和大伤口之间支架周围的纤维囊厚度没有显著差异。支架在小伤口中仍具有较快的降解率。可以识别 POD14 上的降解片段，并且 POD28 上没有任何可见的残留物。 ECM_SW 组织的组织切片也显示出明显的 WIHN 增强迹象：在 POD14 上，小伤口的新上皮呈球状，下面有几个表皮囊肿，而真皮更厚，包裹着降解的支架碎片。随后，我们观察到成熟的 HF 在 POD28 上具有 SG。同样，ECM_SW 组的新生毛囊呈锯齿形，没有色素沉着。两组平均 HF 数的差异也没有统计学意义。基于 bulk-seq 分析，热图显示与 HF 再生、适应性免疫反应或先天免疫反应相关的基因表达变化不大。 Cd3 和 Cd68 的 IHC 染色证实了支架周围或肉芽组织中 T 细胞和巨噬细胞的相似浸润水平。我们使用 scRNA-seq 进一步探索了免疫细胞组成的差异。巨噬细胞的总比例在两组之间是平衡的，ST profiling 的综合分析显示支架周围三个亚群的分布相似。尽管 T 细胞亚群组成略有不同，但多模式分析证实了两组支架周围所有 T 细胞亚群的实质性分布。总之，根据评估，无论伤口大小，生物材料对愈合显示出类似的“促再生”效果。此外，对适应性免疫系统的类似免疫调节作用表明局部免疫环境在HF再生中的重要作用。
Discussion
伤口闭合延迟、易感染、附肢不能再生等问题已成为皮肤伤口愈合的主要障碍。对适当的生物相容性、可降解性和加速上皮化以及促进新生 HF 形成的能力的要求给生物材料设计带来了重大挑战，特别是对于大规模全层伤口。 WIHN 是一种罕见的成年小鼠哺乳动物器官再生模型，其中大的全层伤口 (>1cm2) 仅在伤口中心诱导很少的新生 HF 再生。当 HFP 和 HFSC 与新上皮一起迁移并诱导 Dc（源自 PF）在它们下方聚集时，HF 形态发生的开始开始。已经强调了免疫系统在协调伤口修复的早期阶段的促再生影响。然而，特定免疫亚簇和 HF 前体细胞之间的细胞相互作用仍不清楚。在这里，首先比较了总“疤痕”（小伤口，直径 = 0.6cm）和“半再生”WIHN（大伤口，直径= 1.5 厘米）模型。对小 (Ctrl_SW) 和大伤口 (Ctrl_LW) 样本的多模式分析中，我们观察到来自 Ctrl_LW 组的适应性免疫细胞比例较高，它们位于大伤口中心和边缘，与 HF 前体细胞共定位。它们之间活跃的区域细胞-细胞通讯表明适应性免疫细胞在促进 HF 新生中的“促再生”作用，并为免疫调节材料在皮肤伤口再生中的应用提供了有希望的治疗靶点。接下来，使用 ECM 支架治疗大面积皮肤缺损，并研究其在伤口愈合和免疫微环境调节中的作用。支架显示出对加速伤口闭合和促进新生 HF 形成的影响。结果表明，生物材料对适应性免疫系统具有调节作用。分析发现，响应支架植入的大量 T 细胞浸润被驱动向再生亚群，与丰富的 PF（与 HF 再生有关）重叠。扩大的“促再生”免疫生态位与 HF 前体细胞之间的局部细胞间通讯支持了适应性系统在 HF 再生中的重要作用。最后，证实了支架在大小伤口修复中的促再生作用。支架对 T 细胞的募集具有相似的作用。同时，支架周围的温和FBR降低了免疫排斥的风险，适当的降解率也可以避免二次手术的额外费用。总之，当伤口在头发周期的休止期/退行期产生时再生。 WIHN模型中黑色素细胞的活性值得后续探索。
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