一、动物样品采集、保存和运输（猪、禽）

1.采样单需填写畜牧场的名称、地址、联系人、电话。动物的品种、日龄、数量。免疫情况，临床表现、发病死亡情况以及治疗用药情况等。

2.非洲猪瘟采血需采全血，抗凝血。不采血清。

3.采样后无法送检，需加缓冲液保存。

4.牛、羊选择颈静脉采血，于颈静脉沟上三分之一和中三分之一交界处。

5.猪采用前腔静脉采血，猪头向上提拉与地面呈30度以上，颈部气管两侧，最凹处进针。

6.禽翅静脉采血，在翅下静脉处消毒，手持采血针，从无血管处向翅静脉丛刺入，有血液回流即可。

7.血液倾斜放置2小时，一般血清就可析出。或使用4000转每分钟离心机离心10分钟，可得所有血清，血清放-20℃冻存，全血放4℃冰箱保存

8.组织样品采集，要采集病变的器官组织，或病变和健康组织交界处。先采集实质器官，后采污染的器官组织。

9.牛羊O-P液采集，待牛羊绑定后，用消毒过的探杯，随吞咽动作送入食道，轻轻来回抽动2-3次，然后取出探杯，即可采集到O-P液。

10.样品采集穿防护用具步骤：戴口罩---戴帽子---穿防护服---戴防护眼镜---穿鞋套或者胶鞋---戴手套

11.样品采集脱防护用具步骤：摘下防护眼镜---脱掉防护服---摘下手套---脱掉帽子---脱掉胶鞋或鞋套---摘下口罩

12.实验过程中所产生的废弃物应作无害化处理。实验室内部先进行消毒液浸泡消毒，再使用高压灭菌锅，预处理后，移交给专业的无害无害化处理公司处理。

13.客户寄送样品，需留样15天。

二、样品的接收、制备、留样

1.样品运输需密封、低温（24h内4℃快运、24h以上冷冻），细菌检测样品不能冷冻。

2.样品登记时登记信息应尽可能详细，方便检测出问题时溯源。需检测的项目也应尽可能的详细告知，形成书面报告，方便溯源。

3.血样送检时未放置填充物，可能导致样品溶血。寄送时血清未析出就用2个冰袋将血样包裹，会导致血样温度过低冷冻溶血。

4.新鲜组织不加冰袋会导致腐败。固定组织寄送时加冰，会导致细胞收缩，无法观察细胞状态。

5.样品制备：观察组织找到合适的部位，找到目标兵败你位置取样，3个地方，每个地方一分为二，一份检测，一份留样

6.血液样品：采集后，经离心机离心后，取血清，一分为二，血清量少时贴边吸出，对应编号。

7.废弃物及垃圾，经高压蒸汽121℃30分钟消毒过，交给无害化公司，做好记录。

8.实验结束后，对实验桌、操作台等进行清理与消毒。使用酒精及紫外线灯。

9.各样品按各自要求储存存放，出报告15天后可以处理掉。细菌检测的新鲜组织，不进行留样备份。

10.留样的作用：实验有问题时、客户对结果有异议时可以进行复查。

三、禽病检测

1.病毒仅在活细胞内增值。

2.灭活疫苗在体内无法增值，���产生表面蛋白抗体。弱毒疫苗在体内可以增值，产生表面蛋白抗体和非结构蛋白和内部蛋白抗体，

3.血清学检测技术：凝集实验、沉淀实验、中和实验、免疫标记技术。

4.凝集试验原理：颗粒型抗原或可溶性抗原，与相应的抗体结合后，在适量电解质存在的情况下，可以凝结成凝集块。

5.禽流感病毒可凝集红细胞，但有抗体存在的情况下，可与禽流感病毒结合，抑制这种反应，未血凝与血凝抑制实验。

6可溶性抗原与相应抗体结合后，在适量电解质作用下，可形成肉眼可见的沉淀物，为沉淀实.验。

7.病毒抗原与相应中和抗体结合后，使病毒失去吸附细胞的作用，使其失去感染力，称为中和实验

8.使用酶等示踪物，对抗原和抗体标记后，进行反应，借助于荧光显微镜、酶标仪等仪器，检查结果称为免疫标记技术

9.间接ELISA法优点为可用一种酶标二抗检测各种抗原相应的一抗，缺点是交叉反应高，反应本底高

10.竞争ELISA法的优点是特异性好，缺点是线性关系不好，进检测诱食表位抗体。

四、非洲猪瘟核酸检测原理、操作和全流程质控要点

1.科学流程：临床判断---采样---运输---制样---核酸提取---体系配置---核酸扩增---结果分析---解决方案

2.非瘟特点：所有猪都易感，出血热。特急型、急性、亚急性和无明显症状

3.非瘟抗原特点:潜伏期长，直接接触、基因组大、基因型多，I型和II型都多发，变异毒株多，流行范围广。

4.荧光PCR检测原理：核酸是遗传物质，核酸的结构是核酸检测的理论基础。特点是双螺旋结构、半保留复制、碱基互补配对。

5.PCR检测技术：普通PCR（定性）、荧光PCR（相对定量）、数字PCR（绝对定量）。

6.聚合酶链式反应五要素：DNA聚合酶，Buffer（缓冲液），dNTPs引物、模板

7.核酸检测注意事项：人、机、料、法、环、测

8.所有有可能产生气溶胶的都需要使用生物安全柜，不能使用通风橱。房间有正负压通风最佳，没有也可。做实验时，不要开启通风。

9.核酸检测操作五字诀：温、混、纯、准、稳

19.注意事项：分区、压力气流控制、缓冲走廊、缓冲间、传递窗、人流、物流。

五、血清学检测原理、操作和异常问题分析

1.酶联免疫吸附实验，广泛用于检测各种微量蛋白含量。

2.原理：待检物与固相载体表面，发生抗原抗体结合实验，洗板洗去结合物，假如显色剂，即可根据颜色深浅，进行定性或定量的分析。

3.测抗原方法：双抗体夹心法、双位点一步法、竞争法

4.测抗体方法：间接法、双抗原夹心法、竞争法、捕获法

5.试剂盒组成：抗原包被板、样品稀释液、20X浓缩洗涤液、阴性对照、阳性对照、酶标抗体、显色液A液、B液、终止液、封板膜

6.操作：加样---孵育---洗涤---显色---读数

7.病毒的血凝特性：病毒能使红细胞发生凝集的特性称为病毒的血凝特性。本质是病毒通过血凝素纤突与红细胞表面的相应受体发生特异性结合的过程

8.HA实验结果判断：完全凝集：红细胞呈伞状分布于孔底。不完全凝集：介于两者之间。完全不凝集：红细胞呈明显纽扣状孔底。

9.血凝效价：能使红细胞完全发生凝集的病毒的最大稀释倍数称为病毒的血凝价

10.血凝抑制原理：病毒表面的血凝素纤突遇到抗体相结合后，无法与红细胞表面的相应受体结合，所以不发生红细胞凝集反应。

六、药敏实验

1.目的：疫病检测与诊断，指导临床科学用药，防止抗生素乱用。

2.高压灭菌锅121℃ 15-20分钟。含糖多的话116℃。

3.培养基：给细菌生长繁殖的，由不同营养物质组合配置的营养基质，用于细菌的分离鉴定、纯化培养、传代、菌种保存等。

4.琼脂凝固临界温度42℃，固培养基制作完成后可放置50℃水浴锅中。

5.溶血能力：α：2mm、β：4-5mm、γ：无溶血环

6.细菌的分离鉴定：培养基选择---样本处理---平板划线与培养---菌落形态观察---革兰染色镜检---生化鉴定---PCR或测序---结果判定。

7.药敏实验方法：制片扩散法、稀释法、抗生素浓度梯度法、自动化仪器检测。

8.操作流程：抗生素选择---培养基选择及制备---菌悬液制备---平板涂布---贴药敏片与培养---结果观察及判定

9.质控菌株：对培养基、药敏片进行质控、验证操作技术是否合格。

10.组织不得直接做药敏实验。