PROCEDURE
Design of targeting components and the use of the CRISPR Design Tool ● TIMING 1 d
设计靶组分并使用CRISPR设计工具 1 d
这里我们先前已经完成：CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计
1.输入目标基因组DNA序列
我们提供在线CRISPR设计工具(http://tools.genome-engineering.org) 可以输入序列（例如，来自目的区域的一个1KB基因片段），识别和排列合适的靶位点，计算预测每个指定靶标的off-target位点。或者，可以通过确认任何5’-NGG直接上游的20-bp序列手动选择引导序列。
2.用在线工具确定，订购需要的oligos和引物。如果手动确定分裂位点，oligos或引物应该按照fig4b.c设计
设计ssODN模板（任选） 1 h 我们没有选这个方法--略
3.设计和订购定做的ssODN。
4.重新溶解和稀释ssODN ultramers到终浓度10uM。
Preparation of sgRNA expression construct 准备sgRNA表达结构
5.为了构建sgRNA表达结构，使用PCR表达cassette（选项A）或以质粒为基础的步骤（选项B）--我们选择了方案B
（A）通过PCR扩增构建sgRNA表达结构 2 h--没选这个方案，略
（B）sgRNA cloning进入pSpCas9（BB）质粒，与Cas9共表达 3 d
(i) Preparation of the sgRNA oligos inserts. Resuspend the top and bottom strands of oligos for each sgRNA design (Step 1) to a final concentration of 100 µM. Prepare the following mixture for phosphorylating and annealing the sgRNA oligos (top and bottom strands):
（i）准备插入sgRNA oligos。溶解重悬sgRNA的top and bottom strands（step1）至终浓度为100 μM。准备以下体系使sgRNA oligos磷酸化和退火（顶部和底部组分strands）：具体还可继续调整
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(ii) Phosphorylate and anneal the oligos in a thermocycler by using the following parameters: 37 °C for 30 min; 95 °C for 5 min; ramp down to 25 °C at 5 °C min−1.
（ii）oligos在thermocycler（热循环仪）中磷酸化和退火，参数如下：37℃ 30 min；95℃ 5 min；5℃/min降至25℃。
iii）1：200稀释磷酸化的和退火的oligos（1 μL oligo加到199 μL室温ddH2O中）。
（iv）sgRNA oligos cloning到pSpCas9(BB)。每个sgRNA进行以下反应。我们推荐用一个未插入的pSpCas9(BB)-作为一个阴性对照。注意：如果在之后的应用中用Cas9 D10A切口酶突变体，用pSpCas9n(BB)代替pSpCas9(BB)。或者，如果需要基于荧光或抗生素抗性筛选，则可选择pSpCas9(BB)-2A-GFP、pSpCas9(BB)-2A-Puro、pSpCas9n(BB)-2A-GF或 pSpCas9n(BB)-2A-Puro代替pSpCas9(BB)作阴性对照。以下步骤使用pSpCas9(BB）为例：
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(v) Incubate the ligation reaction for a total of 1 h.
（v）孵育ligation反应 共1 h注意条件还可以再改
(vi) Treat the ligation reaction with PlasmidSafe exonuclease to digest any residual linearized DNA. This step is optional but highly recommended.
(iv)用PlasmidSafe核酸外切酶处理ligation反应，消化残留的线性DNA。这个步骤可选择但高度推荐
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（vii）孵育PlasmidSafe反应：37℃ 30 min，70℃ 30 min（因为我们不做PlasmidSafe实验，所以这一步我们也没有）
Pause point：此处理后，反应可以储存在-20℃至少1周
（viii）转化。转化PlasmidSafe处理的质粒到感受态E.coli菌株，根据细胞提供的说明。我们推荐Stbl3菌株做快速转化。加2 μL产物（step5B vii）到20ul冰上预冷化学处理的感受态Stbl3细胞，冰上孵育混合物10min，42°热激30 s，立即放回冰上2 min。加100 μL SOC培养基，涂到含有100 μg/ml ampi的LB平板。37°孵育过夜。注意，当转化氨苄抗性质粒时，不必要在热激后为了生长期而孵育感受态细胞。
感谢师兄DZ
