hello，情人节到了，大家感觉怎么样？？？感觉很好的举个手，让大家羡慕一下，单身的也没事，相互认识一下，我们以后让别人羡慕，😄。今天给大家分享10X单细胞空间解析肠道干细胞的生理调控，一旦涉及到组织有序性的调控分析，10X单细胞空间必须联合才可以真正达到认识问题的目的，文章在A lymphatic-stem cell interactome regulates intestinal stem cell activity,可能是错觉，感觉老外对待科研的态度要好的多~~~~
Summary
（Barrier epithelia）屏障上皮依赖于常驻干细胞进行体内平衡、防御和修复。小肠和大肠的肠干细胞 (ISC) 对其局部微环境 (niche) 做出反应，以满足对组织更新的持续需求，但它们的生态位的复杂性仍在研究中。在这里，分析报告了一个广泛的淋巴网络，它与这些生态位内的 ISC 密切相关。这里设计了一种淋巴：类器官共培养系统，表明淋巴分泌因子在抑制早熟分化的同时维持 ISC。采用新的反卷积算法 BayesPrism 来配对单细胞和空间转录组学，以高分辨率绘制淋巴配体：ISC 受体相互作用。发现隐窝淋巴管是已知驱动 ISC 行为的 WNT 信号因子（WNT2、R-SPONDIN-3）的主要来源，而 REELIN 是隐窝淋巴管分泌的迄今为止未被重视的 ISC 调节剂。总之，研究将淋巴管作为控制 ISC 再生潜力的niche factors的中心枢纽。
Introduction
在我们的身体和外部环境的界面，屏障上皮细胞必须不断地更新。 这些组织依赖于常驻组织干细胞，这些干细胞增殖以自我更新并补充上皮的分化后代。 在这些组织中，自我更新和分化必须紧密平衡和协调，以防止过度生长或再生和愈合不良。 为了调整它们的活动，干细胞驻留在niches（生态位）中，在那里它们与当地的微环境进行交流，以接收调节其维持和分化的信号（再次强调生态位，也就是空间临近通讯的重要作用）。
The multifariousness of stem cell niches of barrier epithelia is exemplified by the
intestine。小肠组织成重复的隐窝-绒毛单元，包括巨大的上皮表面积，是人体的主要吸收部位，而大肠则组织成重复的隐窝单元，大量定植有益细菌，是维生素和代谢物的关键部位合成。作为人体的主要吸收组织，小肠和大肠都受到动态和全身调节，这表明肠道干细胞 (ISC) 需要整合来自其生态位的线索并在组织范围内协调干细胞行为。然而，自从最初描述隐窝内的 ISC 以来，很明显这些生态位的成分和信号通路是多种多样的。虽然据推测，参与 ISC 维持的关键信号，如 WNT 和 BMP 抑制剂，可能存在于沿着肠隐窝 - 绒毛轴的梯度以指导肠道分化，许多这些信号的性质和来源仍然不完全清楚。同样有待研究的是这些信号在小肠和研究较少的大肠之间可能有何不同，以及信号如何在隐窝之间协调以指导组织中的干细胞行为（单细胞空间技术强强联合才能解决问题）。
成像技术和空间转录组学的改进提供了新的机会来绘制生态位图并以比以往更高的分辨率识别动态响应的 3 维 (3D) 特征，例如脉管系统。这种深度 3 维成像提供了对组织干细胞如何对其微环境作出反应的见解，包括通过与血管和毛细淋巴管的相互作用。在小肠中，粘膜下淋巴脉管系统的乳毛细血管延伸进入吸收性肠绒毛并参与营养吸收和免疫监视。尽管大肠缺乏乳管并且该组织中的淋巴结构特征不太清楚，但小肠和大肠中的粘膜下淋巴管改变是炎症性肠病中肠组织炎症的重要病理特征，炎症性肠病是一种以炎症和上皮细胞为特征的多因素疾病扰动。考虑到这些组织中淋巴脉管系统的空间复杂性，淋巴管是否调节小肠上皮或大肠上皮的 ISC 仍未探索且难以解决。在这里，发现毛细淋巴管是小肠隐窝和大肠隐窝迄今为止未被重视的成分，并且我们表明它们是肠上皮分化的关键调节因子。采用全组织清除和 3D 成像，揭示了毛细淋巴管网络与 ISC 所在的肠隐窝底部之间的密切联系。通过设计淋巴管内皮细胞 (LEC)：类器官共培养系统，我们在体外概括了这种关联，并表明淋巴管分泌，即 LEC 分泌的因子会改变肠道类器官的形态发生和成熟。
为了描述推理的 LEC:ISC 串扰的性质，对成年小鼠的小肠（充满乳腺）和大肠（缺乏乳腺）进行单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和空间转录组学。设计一种新的计算方法，对这些低分辨率空间转录组谱进行反卷积，以重建不同肠细胞类型沿定型隐窝-绒毛和隐窝轴的空间关系。根据沿该轴的细胞位置分配细胞类型特异性转录组的能力能够以高分辨率绘制这些组织的细胞和转录landscope。在这样做的过程中，在隐窝底部确定了一个独特的淋巴调节程序，该程序不同于绒毛内的淋巴功能。通过将这些新发现的计算方法与功能query相结合，揭示了空间 ISC 受体-淋巴配体相互作用及其在调节 ISC 行为和控制组织动力学中的功能重要性。
Results
Lymphatic capillaries neighbor stem cells at the intestinal crypt base
位于小肠上皮的袋状隐窝内的 ISC 的细胞生态位包括邻近的特化上皮细胞（Paneth 细胞）、上皮下间充质细胞（周围成纤维细胞、肌成纤维细胞、基质细胞、滋养细胞）和免疫细胞。 肠道干细胞身份丧失，因为committed的短寿命增殖后代继续沿着隐窝-绒毛轴向上发育，然后根据其微环境、营养可用性和炎症线索分化成不同的分泌和吸收谱系选择之一。 在环境条件基本稳定的正常体内平衡中，单个隐窝内的干细胞以基本稳定的速率再生上皮细胞。
最近，发现淋巴毛细血管与毛囊干细胞 (HFSC) 紧密相关，它们在皮肤上同步毛发再生活动并控制单个毛囊niche的静止。 然而，与经历长时间静止的 HFSCs 相比，ISCs 不断增殖，这让我们想知道在肠道这种另一种上皮屏障组织中，毛细淋巴管是否仍然具有干细胞调节功能，如果是，如何进行调节。
由于像淋巴管这样的血管网络难以通过传统的成像分析进行可视化，因此开始描述肠道干细胞生态位周围的细胞多样性，应用组织清除和整体成像，从而可以可视化 ISC 生态位的 3D landscope ，包括脉管系统的复杂结构。
对小肠的 3D 成像揭示了众所周知的毛细血管丛，该毛细血管丛由血管网络组成，该血管网络沿着绒毛轴围绕中央毛细淋巴管（乳管）。 然而，与乳突一样突出但经常被忽视的是位于隐窝下方的毛细淋巴管的丰富血管网络。 淋巴标记 LYVE1 和 ISC 标记 LGR5+ 的共免疫荧光揭示了这些毛细淋巴管和 ISC 的有趣关联，从一个隐窝底部跨越到另一个。
超微结构分析揭示了淋巴管和隐窝基底 ISC 之间的紧密物理接近，通常仅由一层薄薄的细胞外基质 (ECM) 隔开。 针对先前确定的隐窝间充质细胞和免疫细胞的标记显示，淋巴网络与 ISC 生态位的成分交织在一起。 在某些情况下，发现毛细淋巴管突起与隐窝底部直接接触。
淋巴乳管是肠道中营养吸收和免疫细胞运输的成熟途径。 在绒毛中，乳腺通过血管网络、免疫细胞和丰富的基质细胞与上皮细胞分离。 相比之下，隐窝底部的毛细淋巴管与常驻上皮细胞密切相关，包括 Paneth 和 LGR5+ 干细胞和祖细胞。
鉴于小肠淋巴管在营养吸收中的关键功能，研究considered that lymphatic endothelial cell proximity to the crypt base might be merely a necessary component of their path from the lacteals to the collecting vessels which flow into mesenteric lymph nodes and ultimately deliver nutrients into the systemic circulation through the thoracic duct. 如果小肠中的淋巴：SC 接近只是乳酸聚集的结果，那么不会期望在大肠中观察到这种情况，因为大肠的淋巴血管系统没有乳酸，并且在营养吸收中起着名义上的作用。
结肠淋巴管，即大肠淋巴管，已知在肠道免疫监视和调节中具有重要作用，但毛细血管网络的结构尚未完全表征。 有趣的是，基于隐窝的 LGR5+ SCs 与整个肠道的毛细淋巴管有关。 虽然结肠 ISC 生态位缺乏Paneth细胞，但大肠中的大多数 LGR5+ 隐窝至少部分位于毛细淋巴管上方，这让人想起我们在小肠中观察到的情况。
超微结构分析显示，大肠中的 ISC 和毛细淋巴管之间存在类似的密切关系。 值得注意的是，淋巴-ISC 关联在人类中也是保守的，在大肠活检标本中发现了与隐窝上皮细胞相关的淋巴毛细血管。当之前对毛囊淋巴毛细血管网络的发现结合起来时，这些数据表明，无论干细胞是静止的（毛囊）还是快速循环的（大肠和小肠），毛细淋巴管都可以与上皮干细胞niche形成错综复杂的关联。 这些新发现提出了一个问题，即这种近距离接触是否有共同目的以及淋巴管在组织维持中的作用。 因此，研究试图定义和描述毛细淋巴管对 ISC 行为的表型影响。
Lymphatic endothelial cells instruct intestinal organoid development and maturation（淋巴内皮细胞有助于肠道类器官的发育和成熟）
为了测试淋巴内皮细胞是否直接向肠上皮发出信号，利用培养小肠上皮干细胞的能力来生成 3D“小肠”类器官，并建立了一个与原代小鼠 LEC 共培养类器官的系统。该系统概括了在体内观察到的淋巴管内皮细胞和小肠干细胞之间的联系，能够区分由于直接的细胞间通讯而产生的效应和由在该共培养系统中不存在的淋巴引流特性引起的效应。在共培养条件下（50% 常规类器官培养基：50% LEC 培养基），LEC 保持关键淋巴转录因子和蛋白质标志物（PROX1、CD31 和 LYVE1）的表达，以及在该培养基中在 Matrigel 上培养时形成内皮管的能力。同样，在共培养基中单独生长的类器官也保持了关键特征，包括形成隐窝结构域的能力。
与单独培养的隐窝相比，与淋巴内皮管一起培养的 ISC 或分离的隐窝产生的类器官具有显著的形态变化。 在存在 LEC 的情况下形成的类器官尺寸更小，形状更圆形，并且包含更少的隐窝结构域，表明成熟受损。 然而，重要的是，这些类器官展示了产生溶菌酶的Paneth细胞，这是小肠隐窝的关键成分，对 ISC 维持至关重要。 这一点，以及在存在 LEC 的情况下类器官形成的维持能力，表明毛细淋巴管本身并没有损害类器官的形成。 相反，LEC 的存在似乎阻止了它们的成熟。 当 ISCs 与血管内皮细胞 (BECs) 共培养时，没有观察到这种效应，强调了淋巴管内皮在抑制隐窝分化方面的特异性。
为了进一步了解这些效应的性质，对来自 LEC 共培养的类器官进行了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)，并将它们与从在相同培养基中生长的标准类器官培养物中获得的 scRNA-seq profile进行了比较。这里汇集了两种培养条件下的细胞并进行了聚类。细胞类型独立于培养条件聚集并分成 11 个clusters。明确指定了两个表达 Goblet/Paneth 细胞（例如 Lyz1、Muc2）和肠内分泌（例如 Chga、Chgb）标记物的clusters。此外，表达干细胞/祖细胞和转运扩增 (TA) 细胞（例如 Olfm4、Ascl2、Tubb5、Top2a）的标记的四个clusters被标记为干细胞/TA。最后，五个clusters表达肠细胞标志物，如Alpi和Fabp1，并与沿着绒毛带位置轴的肠细胞分化程序相关；将它们相应地标记为bottom-like 1、bottom-like 2、mid-like 1、mid-like 2、top-like。
在存在 LEC 的情况下生长的类器官显示出显著较少的终末分化肠细胞，尽管干细胞和祖细胞的比例相似。 这些发现也与基于最近邻图的差异丰度分析 (Milo) 一致，这提供了更精细的分辨率。 该分析产生了进一步的见解，揭示了在 LEC 存在下生长的类器官显示出干/祖细胞clusters内细胞分布的改变和肠上皮祖细胞的倾斜，而牺牲了完全（终末）分化的肠上皮细胞。
LEC 共培养的类器官在与活跃循环 (Mki67+) 细胞相对应的细胞部分中的代表性也不足。 与活跃循环的肠道干/祖细胞数量减少一致，在 LEC 存在下生长的类器官中，10 分钟脉冲期间 5-乙炔基-20-脱氧尿苷 (EdU) 的掺入减少。 与肠细胞终末分化阻滞一致的是成熟肠细胞标志物醛缩酶 B (ALDOB) 的免疫荧光减弱。 此外，在转录组水平上，与定义top区域的基因相比，来自共培养条件的肠细胞上调了定义底部区域的基因。
为了更好地理解两种条件之间成熟度的差异，对分化轨迹进行了计算建模并量化了可能的分化路径。 从对照类器官中获得的肠细胞在最终分化的顶部区域内更频繁，而从 LEC 共培养的类器官中获得的肠细胞更均匀地分布在中间状态。 总之，这些数据支持一个模型，即隐窝底部的淋巴管内皮细胞维持干细胞和祖细胞，但限制它们分化为成熟的肠上皮细胞。
The lymphatic secretome maintains ISCs but restricts their terminal differentiation(淋巴分泌组维持 ISC，但限制其终末分化)
如果正如迄今为止的研究预测的那样，隐窝淋巴管通过支持维持肠干细胞和祖细胞而不是快速循环和终末分化的细胞来发挥作用，那么淋巴管内皮细胞应该提高从初级类器官分离的单个细胞形成二级类器官的效率。 此外，如果隐窝淋巴管也能防止 ISC 终末分化为成熟的肠细胞，那么与在相同培养基中但没有 LEC 的情况下形成的二级有机体相比，该测定中出现的有机体的大小应该减少。
为了检验这些假设，首先评估了 LEC 支持类器官生长的能力。 事实上，LEC 的存在使单个 ISC 的类器官形成效率增加了一倍以上。 与隐窝衍生的类器官类似，在 LEC 存在下生长的单细胞衍生类器官更小，突起更少。 正如预测的那样，LEC 共培养的类器官也表现出降低的 ALDOB 免疫荧光，这与肠细胞生成受阻一致。
并非所有类器官都与 LEC 接触，但大多数类器官仍显示出尺寸减小和差异化。 同样，许多但不是所有的隐窝在体内显示出与毛细淋巴管密切相关，即使它们这样做了，LGR5+ 干细胞和 LEC 之间的直接细胞间接触似乎也非常罕见。 因此，推断 LEC 分泌的（淋巴管分泌）因子可能是在共培养类器官中观察到的表型的原因。 为了验证这一假设，收集了 LEC 条件培养基，并检查了它在没有 LEC 本身的情况下影响类器官起始和成熟的潜力。 LEC 条件培养基概括了 LEC 共培养的类器官的表型，显示出较小的类器官和较少分化的后代。
接下来，从在 LEC 条件培养基中生长的类器官中分离出单个细胞，然后将它们置于没有 LEC 的正常类器官培养条件下，出现了两个重要的发现。 首先，LEC 条件培养基在这些二次试验中提高了 LEC 条件 ISC 祖细胞的类器官群落形成效率，从而强调了淋巴管分泌因子对 ISC 维持的有效和直接影响。 其次，一旦淋巴管分泌因子不再存在，由这些预处理的 ISC 形成的类器官就会正常分化，这表明 LEC 损害 ISC 分化的作用是可逆的，并且取决于持续暴露于这些淋巴管分泌因子。 在组织的背景下，这种影响应该主要表现在隐窝生态位内，干细胞和淋巴管所在的地方以及它们的分化受到抑制的地方。
The in vivo spatial map of cell types in the small and large intestines
接下来转向解决隐窝淋巴管分泌因子的性质，并揭示它们如何影响体内肠道干细胞。 由于乳淋巴管可能产生与位于隐窝底部的淋巴管完全不同的一组因子，因此有意义的结果需要空间转录组学方法。 因此，试图通过计算整合 scRNA-seq 和空间转录组数据，沿隐窝绒毛轴（小肠）和隐窝轴（大肠）的空间维度绘制肠细胞类型及其基因表达谱。 这种方法能够（1）识别由 LEC 高度和/或独特表达的基因，以及（2）将 LEC 基因表达模式与肠上皮内淋巴管和 ISC（或其他潜在接收细胞）之间的空间接近度相关联。
这里收集了来自小肠和大肠的肠细胞的综合 scRNA-seq 谱，涵盖了肠道内免疫、基质和上皮谱系的主要细胞类型，同时含有了稀有的 LEC 和 LGR5+ ISC populations。 小肠和大肠的免疫细胞各自包含主要的淋巴（T细胞、B细胞、浆细胞和生发中心B细胞）和骨髓（巨噬细胞、树突细胞、单核细胞和粒细胞）细胞群。 类似地，基质细胞根据胶质细胞（例如 S100b、Gfap）、血液内皮细胞（例如 Cd31、Cdh5）和淋巴管内皮细胞（例如 Lyve1、Prox1）、肌成纤维细胞（例如 Acta2、Myh11）和成纤维细胞（例如 Col6a2、Dpt）标记基因聚集 . 聚类进一步揭示了间充质细胞群的异质性，如由滋养细胞（例如 Cd81）、远程细胞（例如 Foxl1）和隐窝基质细胞（例如 Cd34、Pdpn）的标记所定义的。最后，小肠和大肠的上皮细胞反映了所有主要的分化谱系，如肠上皮细胞（例如 Alpi、Fabp1）、杯状细胞（例如 Muc2）、肠内分泌细胞（例如 Chga、Chgb）、簇状细胞（例如Dclk1）和Paneth细胞（例如 Lyz1、Defa17），后者在大肠中不存在。杯状细胞表现出高度的异质性，占大肠上皮细胞的很大比例。未成熟的上皮细胞分离成分泌前体（例如 Atoh1、Dll1）、转运放大细胞（例如 Stmn1、Tubb5）和 Lgr5+ 祖细胞。在两个 scRNA-seq 数据集中都发现了由 Lgr5 和 Olfm4 标记的真正 ISC。
虽然这些早期群体仅占小肠总隐窝上皮细胞的 4-6%，但富集策略能够将 LGR5+ 干/祖细胞的数量增加到总群体的约 30%，提供这些稀有种群的深层分子特征。 总之，这些数据构成了前所未有的小鼠结肠上皮综合图谱，以及小鼠小肠和大肠细胞群特别是 ISC 的宝贵转录组资源。
深入挖掘，接下来对匹配的组织样本进行空间转录组学（10X Visium 平台），这些样本针对上皮细胞 (EpCAM)、ISC (OLFM4) 和 LEC (LYVE1) 进行了免疫标记。 用于空间转录组学 (10X Visium) 的商用平台是一种有价值的工具，但分辨率有限，每个条形码点（直径约 50 微米，中心距为 100 微米的点）通常包含多种细胞和细胞类型。 这种限制排除了相邻细胞之间相互作用的表征。 这对我们的兴趣尤其成问题，即剖析 ISC 与其niche components之间的相互作用，因为这些细胞类型通常组合在一个spot内。 了解生态位中细胞类型之间相互作用的性质需要对（1）每个spot内的细胞类型和（2）每个细胞在给定空间位置表达的基因进行去卷积的方法。
为此，我们使用了 BayesPrism，这是一种贝叶斯统计模型，通过使用来自匹配组织的 scRNA-seq 参考作为先验信息，联合反卷积每个空间点内的细胞类型组成和细胞类型特异性基因表达谱。 该方法在bulk RNA-seq 反卷积中明显优于其他基于回归的工具，并且其对平台批次效应、技术伪影和噪声的稳健性使其特别适合空间反卷积，将每个 Visium 点视为批量 RNA 样本。 此外，在 scRNA-seq 策略中对 LEC 和 LGR5+ ISC 的富集允许准确推断肠素中这些稀有细胞类型。
通过将它们与沿隐窝绒毛或隐窝轴的预期细胞类型分布以及测序组织的免疫荧光图谱进行比较来验证我们的去卷积分配。 将 BayesPrism 与为空间转录组数据开发的其他反卷积工具进行基准比较，发现 BayesPrism 与预期的标记基因表达模式具有最高的一致性（单细胞空间联合分析）。
Cell type and expression cartography reveals in vivo lymphatic:ISC interactome
虽然 Visium 允许绘制基因表达的空间模式，但它在基因测量中的有限分辨率和稀疏性排除了我们询问niche：ISC 相互作用所需的高分辨率空间基因表达图。 为了构建能够揭示细胞-细胞相互作用的隐窝-绒毛轴基因表达的高分辨率制图，开发了 SpaceFold 轴投影。 为此，使用每个点的细胞类型分数的非线性降维来沿一维 (1D) 伪空间轴投影每个 Visium 点。
SpaceFold 利用了数百个高度刻板的肠上皮结构，每个结构都由小肠中重复的隐窝-绒毛单元或大肠中的隐窝单元组成。 尽管小肠和大肠之间存在固有差异，但各自组织内的每个隐窝在大小和细胞类型沿隐窝-绒毛或隐窝轴的排序方面相似。 假设，随着空间spot沿该定型轴随机采样，每个空间点的细胞类型组成，如 BayesPrism 所推断的，将告知细胞沿一维人工隐窝绒毛 uni 的相对物理坐标。
事实上，SpaceFold 推断的一维伪空间分别很好地概括了沿着小肠隐窝绒毛和大肠隐窝轴的预期细胞类型分布。吸收性肠细胞cluster沿绒毛轴映射，由绒毛区标记基因预测，底部和顶部区肠细胞落入各自的位置。有趣的是，投影轴将含有隐窝毛细淋巴管的spot与乳淋巴管区分开来，后者从基底毛细淋巴管床延伸到小肠中肠绒毛的尖端。值得注意的是，大肠数据集中不存在这种突起，这与该组织中不存在乳腺一致。重要的是，该图还概括了 ISC 生态位细胞沿该轴的已知分布，含有滋养细胞的基质 3 样种群落在其预测的小肠和大肠隐窝底部下方的位置。
接下来绘制了每种细胞类型的基因表达谱。基于每个空间spot中去卷积的细胞类型特异性基因表达谱，绘制了已建立的上皮细胞（例如 Lgr5 作为 ISC 的标志物，Defa5 作为潘氏细胞的标志物）和基质（例如 Grem1 作为隐窝的标志物）的转录水平。基于基质细胞/滋养细胞）沿投影的隐窝绒毛轴的每个点的标记基因。在标记基因表达与其相关细胞类型的预期空间分布之间发现了高度一致性。肠绒毛上皮细胞区标记物也可预测地沿投影绒毛轴分布。总之，通过准确地对细胞类型组成进行反卷积，推断每个空间点内的细胞类型特异性基因表达谱，并通过 SpaceFold 生成定型轴投影，能够获得细胞类型和细胞类型的高分辨率制图-小肠和大肠中的特定基因表达谱，分别沿着隐窝绒毛和隐窝轴。尽管研究的重点是 LEC：隐窝生态位中的 ISC 相互作用，但数据和制图为绘制肠道中其他细胞类型之间的相互作用提供了丰富的资源。
Lymphatic capillaries are a local source of stem cell niche factors
随着小鼠肠道的去卷积空间转录组和淋巴衍生的分泌因子在体外调节类器官行为的知识，准备解开能够在体内向 ISC 发出信号的空间相关隐窝淋巴管生成配体。 从单细胞 RNA-seq 数据集中获得在淋巴管内皮细胞中显著水平表达的基因（在超过 20% 的 LEC 中表达），但在相关的血液内皮细胞中没有（在不到 20% 的 BEC 中表达）。 根据这些，根据编码预测分泌和细胞外定位的 N 端信号肽的序列的存在，生成了 12 个编码蛋白质的基因列表，这些蛋白质很有可能被分泌到细胞外。
接下来检查了这 12 个 LEC 衍生因子在隐窝生态位的不同细胞类型中的中值表达。排除了与 ISC 功能直接相关的可能性低的那些（例如那些编码在抗菌肽或参与凝血级联或铜代谢的蛋白质中起作用的蛋白质），以关注 5 个候选淋巴管分泌因子的列表。同时，使用高分辨率、细胞类型特异性、伪空间转录组制图以细胞类型特异性方式绘制这些基因中的每一个沿隐窝-绒毛轴的空间表达。从这些分析中，了解到其中一些基因，例如。 Ntn1 和 Il33 在淋巴管中显示富集但不是唯一的表达。相比之下，Reln、Ccl21a、Rspo3 和 Wnt2 在 LEC 中的表达高于其他生态位细胞，并且在隐窝底部的生态位淋巴管中富集。在这四个因子中，主要由基于隐窝的淋巴管内皮细胞表达，三个具有由小肠和大肠中的 ISC 表达的受体，使其成为在隐窝生态位内介导 LEC:ISC 信号传导的 strong candidates。
由 Rspo3 编码的 R-SPONDIN-3 与 LGR5 结合并增强肠干细胞中的 WNT 信号传导。 虽然它最初被确定为间充质细胞产生的一个因子，但最近报道 Rspo3 表达也由淋巴管表达。 转录组数据清楚地证实了基于隐窝的淋巴管是这种重要的 ISC 配体的主要来源。 虽然 WNT2 尚未在隐窝淋巴管的背景下进行研究，但它已添加到由 Paneth 和小生境间充质细胞表达的规范 WNT 列表中。 鉴于 WNT-Frizzled 信号在 ISC 维护中的重要性，这些因素在基于隐窝的 LEC 中的重要性提高了淋巴管作为 ISC niche的关键新组成部分的重要性。
虽然 R-SPONDINs 和 WNTs 在 ISC 功能中的作用已经确立，但 REELIN 以前并未被描述为 ISC 生态位因子，而是作为参与神经元迁移和心脏重塑的大型细胞外基质蛋白。 鉴于 REELIN 的主要受体 Vldlr/Lrp8 和 Itgb1 均由 ISC 表达，而 Reln 由基于隐窝的淋巴管选择性表达，因此它成为引发 LEC 对 ISC 维持和分化影响的good candidate。
通过免疫荧光判断，REELIN 在培养的 LEC 中表达，组织清除和整体成像证实了它在 LEC 中的丰富表达，这些 LEC 集中在小肠和大肠的隐窝基底毛细血管网络中。 最引人注目的是，在标准类器官培养物中添加重组 REELIN 概括了与 LEC 共培养和/或在 LEC 条件培养基中培养的类器官的表型，REELIN 处理的类器官表现出尺寸减小、圆形度增加和隐窝结构域数量减少。 这些数据强调了淋巴管生成分泌组在控制 ISC 行为和维持肠隐窝生态位干性方面的功能重要性和生理相关性。 此外，我们的研究阐明了整合转录组和高分辨率空间分析在剖析干细胞生态位的复杂性和识别新的生态位成分方面的力量。
Discussion
Lymphatics and the Intestinal Stem Cell Niche
已知 WNT 和 BMP 的逆梯度以及其他信号是由肠隐窝生态位的不同细胞成分产生的，以影响 ISC 的自我更新和健康和疾病的分化。然而，这些线索的综合性质以及它们如何动态协调以协调跨组织的干细胞行为仍未完全了解。之前发现淋巴毛囊为皮肤中的毛囊干细胞形成了一个动态的生态位，这些细胞经历周期性的静止和再生活动以驱动毛发周期。与皮肤相比，肠道淋巴网络的重点是乳管，它是由血管网络包裹的中央毛细淋巴管，从肠黏膜下层延伸到绒毛，并具有运输膳食脂质和营养物质、免疫监视和流体平衡调节。尽管与小肠乳管相连，但整个肠道隐窝下方的毛细淋巴管网络在很大程度上被忽略了。在这方面，3D 成像揭示并通过超微结构分析证实的 ISC 隐窝和淋巴管之间的密切关系既显著又intriguing。
建立的淋巴器官共培养系统揭示了淋巴内皮细胞对维持 ISC 的自我更新能力和适应性同时抑制其分化的有效作用。 将此特征追溯到淋巴管分泌的因子，因为 LEC 条件培养基足以引发类器官的这些表型变化。 重要的是，当预条件 ISC 在正常的类器官培养条件下生长时，与在正常培养基中培养的 ISC 相比，它们保留了优越的组织再生活性。 然而，在条件培养基中去除 LEC 分泌因子后，这些 ISC 能够沿着其分化谱系正常发展。
Lymphatics as a Signaling Hub for Tissue Stem Cells
没有采用蛋白质组学方法来识别所涉及的淋巴因子，而是设计了一种转录组策略来获得candidates，然后可以对其进行功能性询问。 BayesPrism 将 10X Visium 空间转录组学与scRNA-seq 数据整合在一起，不仅可以揭示细胞类型分数，还可以揭示每个spot的细胞类型特异性基因表达谱。利用基于 scRNA-seq 的参考图谱通过新的 SpaceFold 方法对低分辨率空间转录组数据进行反卷积，通过计算重建了隐窝-绒毛单元的空间组织。该分析揭示了小肠和大肠内每个细胞的高分辨率空间图及其空间决定的基因程序。通过富集淋巴管内皮细胞和稀有的 LGR5+ 祖细胞，这些图谱变得更加有意义。这可以通过在肠隐窝-绒毛轴上剖析淋巴管内皮网络内的转录异质性以及识别隐窝底部毛细淋巴管特异性产生的因子的能力来说明。
这一策略非常有效地指导我们找到直接指导 ISC 发育和成熟的独特淋巴管分泌信号。 通过定位生态位信号和/或其 ISC 受体，一种机制浮出水面，即从其生态位信号中置换出来的 ISC 后代执行分化程序。 当重新繁殖在 LEC 条件培养基中生长的类器官时，我们在体外的研究结果证实了这一点。 我们的制图方法澄清了先前关于 Rspo3 主要来源的模糊性，编码 LGR5+ ISC 的关键 WNT 增强生态位信号，并将 REELIN 确定为隐窝生态位内向 ISC 发出信号的额外淋巴候选因子。 事实上，在类器官模型中，已知 RSPONDIN（RSPO-1 包含在我们的 ENR 类器官培养基中）对于 ISC 维持至关重要，正如展示的，REELIN 对类器官的发育和成熟也有直接而明显的影响。
在重新审视 HFSC 生态位时，周围的毛细淋巴管在干细胞维持和毛发再生中起关键作用，有趣的是，Reln（在 LECs 中）和 Lrp8/Vdlr/Itgb1（在 HFSCs 中）也被表达，这表明它的保守作用组织干细胞niche中的 REELIN 信号传导。 此外，尽管肠道和皮肤中的干细胞活动和组织再生存在差异，但淋巴管的功能似乎相似，即通过控制干细胞生态位内的维持和再生活动。 在这方面，有趣的是，尽管干细胞生态位具有一些保守的特征，正如我们在这里发现的那样，但其他一些特征似乎是为适应每种组织的特定需求而量身定制的。
The Power and Universality of Our Computational Strategy in Unearthing Intercellular Interactions Within Tissues
虽然超出了当前研究的范围，但在这里绘制的高分辨率空间图以及相关的小肠和大肠细胞的深层单细胞分析现在提供了丰富的数据集，以query对空间定义的细胞类型和基因表达程序的更多见解以及肠道内的细胞相互作用。虽然大多数先前的研究只关注从空间转录组学推断细胞类型分数，但我们的研究强调了推断空间分辨的细胞类型特异性基因表达的重要性。此外，该方法也可以应用于由空间有序单元组成的其他组织的空间转录组数据。在这方面，BayesPrism 的两个特点使其对其他空间转录组数据集具有高度的泛化性：（1）它不依赖于在 scRNA-seq 数据中观察到的细胞类型比例，使其对富含稀有细胞类型的数据集特别有效(2) 它对技术甚至生物学变异具有鲁棒性，因此不需要通过 scRNA-seq 和空间转录组学分析的完美匹配的样本。
利用刻板的隐窝绒毛和隐窝单位，SpaceFold 能够将我们的转录组数据压缩到一维空间轴上，从而促进我们对肠道中空间受限基因表达的分析。 SpaceFold 可以类似地应用于其他定型组织结构（例如毛囊），并且可以扩展以将每个点投影到二维上，以构建更复杂组织单元的 2D 制图。
Broader Implications for Lymphatic-ISC Interactions: Looking Ahead.
尽管在这里专注于淋巴管内皮细胞和 ISC 之间的直接通讯，但淋巴管也可能介导其他隐窝动力学，包括特定生态位信号分子的运输、液体引流和免疫细胞与 ISC 的串扰。Indeed, while immune cells can directly signal to stem cells to orchestrate pathogen responses, immune-mediated damage of ISCs is a common feature of graft-versus-host disease, in which lymphoid organs are damaged, suggesting an important role for immune cell drainage from the niche via lymphatics.
由于淋巴管可以发挥的作用的多样性，它们与 ISC 的关联也可能对疾病状态产生重要影响。 在这方面，肠炎性疾病与淋巴管扩张、黏膜下水肿、淋巴阻塞、淋巴结病、淋巴管扩张和淋巴管生成有关。 此外，肥胖会改变 LEC 的密度、增殖和渗透性。 淋巴管中的任何或所有这些扰动都可能直接影响 ISC。 为了指导未来的治疗，重要的是询问淋巴转录组在疾病状态下是如何改变的，它如何解释炎症和代谢线索，以及它如何将它们传递给 ISC niche。
Method
scRNA-seq data analyses（我们来总结一下）
- remove ambient RNA molecules ---- CellBender
- removed low quality cells ---- i) genes detected in fewer than 3 cells, ii) cells with under 200 genes or 1000 UMIs, and iii) cells with a mitochondrial fraction above 15%.
- emove doublets ---- performance of both DoubletDetection and Scrublet 。
-
降维选择的高变基因 ---- 5000
图片.png - 轨迹推断 ---- CellRank，CytoTRACE、Palantir。
BayesPrism algorithm（单细胞空间联合算法）
生活很好，有你更好，大家情人节快乐~~~
