文章信息：
文章题目：Integrated single-cell profiling dissects cell-state-specific enhancer landscapes of human tumor-infiltrating T cells
期刊：bioRxiv
链接：https://doi.org/10.1101/2022.03.16.484513
摘要：
耗竭性T细胞在肿瘤组织中普遍存在，并且存在一定的异质性。尽管人们对耗竭性T细胞的染色质可及性特征进行了广泛研究，但肿瘤浸润T淋巴细胞（TILs）的异质性和功能障碍的潜在转录重塑机制仍不太清楚。在本研究中，我们利用单细胞ATAC-seq技术从四种原位瘤的TILs细胞中鉴定了不同功能状态的CD8+ 细胞的组织特异性和共有的基因调控元件。通过单细胞ATAC-seq和RNA-seq多组学整合分析获得了肿瘤TILs细胞的增强子-启动子互作图谱，并鉴定了细胞状态特异性的超级增强子调控元件。同时，基于单细胞染色质可及性拟时序分化轨迹推断分析，我们鉴定了耗竭性T细胞在功能障碍的分化过程中的关键增强子元件、转录调控因子和靶基因。最后，我们通过CRISPRi/a干扰技术验证了T细胞耗竭关键基因的增强子调控元件。总之，我们的研究为理解和操纵人类肿瘤浸润T淋巴细胞不同细胞状态特异性基因的调控元件提供了理论基础和分析框架。
关键词：
T cell exhaustion, chromatin, gene regulation, CRISPR activation, CRISPR interference, enhancer, single-cell multi-omics, cancer immunity
背景：
功能障碍T细胞，也叫耗竭性T细胞（Tex），其清除病原体和恶性肿瘤细胞的能力受限。最近的研究集中关注在T细胞功能障碍的机制上，已有的研究表明T细胞在功能失调过程中的染色质景观发生了进行性和部分不可逆的重编程，并伴随着效应功能受损、增殖和存活能力减弱[1]。染色质状态的改变将T细胞锁定在其功能失调的状态，因此，通过检查点阻断来实现T细胞长期活力的恢复能力受限[2]，并阻碍了嵌合抗原受体（CAR）T细胞的过继细胞疗法[3]。重要的是，在最近的几项研究中，人们在耗竭性T 细胞池中发现了一群具有较强自我更新能力的细胞，这群细胞可以对检查点阻断疗法作出反应，并产生对病毒或肿瘤控制至关重要的终末分化细胞[4-9]。因此，深入探究人类 TILs细胞的异质性和调控机制对于理解和改善细胞免疫疗法的反应至关重要。
在分子水平上，调节基因表达的耗竭特异性远端调控元件（如增强子）可以有效区分功能失调和功能性 T 细胞的状态，这些增强子元件调控T 细胞功能障碍相关基因的表达，如免疫检查点程序性细胞死亡 1 (PDCD1)[10]。单个增强子元件调控淋巴细胞的功能已得到了充分证实，但人们仅在全基因组范围内数十万个调控区域的一小部分有了一定的了解。一个典型的例子是Th2 细胞因子基因座的调控区域，它通过染色质远程相互作用调控细胞状态依赖的IL-4、IL-5 和 IL-13 基因的特异性表达[11]。增强子对 T 细胞状态的信号依赖性功能调节作用进一步体现在 IL2RA 基因（编码 CD25，高亲和力 IL-2 受体的一个亚基）上，该基因中一个内含子 DNA 元件的缺失导致了初始 T 细胞从诱导的 Treg 细胞极化为体内促炎的Th17 细胞[12]。另一项研究表明，PDCD1基因上游增强子元件的缺失降低了抗原特异性CD8+ T 细胞中活化诱导的PD1的表达，从而增加了记忆 T 细胞的形成并改善了体内肿瘤的控制[13]。与人类系统类似，PDCD1基因远端增强子元件的缺失降低了CAR-T 细胞在慢性感染体外激活期间共抑制受体 PD1 的表达[14]，这表明增强子元件的编辑可以改善免疫治疗的疗效。因此，研究细胞状态特异性增强子元件的调控作用，对于理解免疫系统过程的分子机制（如 T 细胞功能状态变化）至关重要。然而，目前人们对人类 TILs 细胞中增强子元件的调控作用机制受到了一定的限制。
首先，关于T细胞功能障碍的染色质动力学数据主要来源于癌症或慢性感染模型小鼠或健康人类供体 T 细胞的批量分析[1,2,10,15-17]。尽管人们通过多种计算方法努力统一不同模型中的T 细胞染色质数据，但慢性感染和癌症模型之间的差异是大家公认的[18]。与此一致，最近关于 CAR-T 细胞耗竭的研究揭示了小鼠和人类 T 细胞功能障碍特异性调节组之间的差异[14]，这是由于与蛋白编码基因相比，增强子元件在不同物种之间的保守性较低[19]。到目前为止，只有少数的研究探究了单个癌症实体中人类 TIL细胞的单细胞染色质景观[20]。因此，目前仍缺乏对异质性T 细胞染色质状态及其在人类不同癌症中相关增强子景观的全面和概括描述。其次，人们对远端非编码调控元件的染色质变化与其受调控靶基因之间的相互作用关系也不太了解。由于增强子可以发挥远距离作用，因此解析增强子-启动子的互作关系对于产生关于体内关键基因调控的假设至关重要。第三，由于染色质互作研究通常会产生数千个假定的细胞状态特异性增强子元件，因此迫切需要对基因及其互作的增强子元件进行优先排序，以解析不同功能性和功能失调T 细胞状态的关键调控元件，从而改善CAR-T等细胞治疗产品的疗效。
在本研究中，我们试图鉴定人类 TILs细胞中关键基因的增强子调控元件。我们通过对多个病人来源的四种癌症实体进行单细胞ATAC-seq和RNA-seq整合分析，预测了大量的功能性和功能障碍T细胞状态的潜在增强子-启动子互作链接，并通过超级增强子分析从中筛选出关键调控元件。最后，我们使用CRISPR干扰技术验证了编码PD1和TCF1关键基因的增强子元件。总之，我们的研究表明，尽管人类 TIL细胞发生了组织特异性重塑，但在T细胞功能和功能失调状态下存在统一的核心基因调控模式，这些模式可以通过 CRISPR 激活/干预的增强子靶向来调节。从某个角度来看，我们的研究提供了一个分析框架，在癌症背景下人们可以通过编辑非编码基因组来控制T 细胞的关键基因表达。
测序信息：
本研究从三种原位瘤HCC, ccRCC和HNSCC的肿瘤样本中分离TLIs细胞，利用改进优化后的单细胞ATAC-seq测序技术进行单细胞测序分析，并从公共数据库中下载配套的单细胞RNA-seq测序数据进行整合分析。同时，还从已发表文章的公共数据中下载了BCC肿瘤样本的单细胞ATAC-seq和RNA-seq数据。
结果解读：
1.构建了人类肿瘤浸润CD8+T细胞的单细胞染色质可及性图谱
为了探究人类肿瘤浸润TILs细胞的染色质可及性动态变化特征，我们利用改进优化后的单细胞ATAC-seq技术进行测序分析。通过优化细胞裂解缓冲液和建库流程，我们可以得到信噪比更高、双细胞比例更低的测序数据。基于优化后的测序流程，我们从不同肿瘤样本（头颈鳞状细胞癌HNSCC: 4 patients, 13 samples; 肝细胞癌HCC: 4 patients, 13 samples; 肾透明细胞癌ccRCC: 4 patients, 13 samples）中分离了CD8+PD1+和CD8+PD1-的TILs细胞进行测序分析。其中，在ccRCC和HCC肿瘤中还提取了癌旁正常组织的样本，以及正常供体PBMC来源的CD8+T细胞（5 donors, 9 samples）作为对照。同时，我们还从已发表公共数据中获得了基底细胞癌BCC（4 patients, 7 samples）的单细胞数据。经数据质控和过滤后，得到了不同肿瘤TILs CD8+T细胞的高质量染色质可及性数据。
Figure 1: scATAC-seq workflow and flow cytometric analysis of patient samples
为了得到肿瘤TILs中不同功能状态T细胞的染色质可及性特征和转录调控图谱，我们对不同肿瘤样本的TILs细胞进行了批次矫正和整合，进一步降维聚类分群得到了11种不同功能状态的T细胞亚群。基于基因活性得分对不同T细胞亚群进行差异分析，共得到了8,453个细胞类群特异的差异表达基因，表明不同功能状态的T细胞具有各自特异的染色质可及性特征。如，cluster7 MAIT细胞具有较高的ZBTB16基因活性，cluste6 naive CD8+ T细胞具有较高的LEF1基因活性，cluster11 memory T细胞具有较高的IL7R基因活性，cluster10 Tpex细胞具有较高的CXCR5和TCF7基因活性，cluster1-4 Dysfunctional T细胞具有较高的HAVCR2, ENTPD1和TOX基因活性。为了进一步验证我们细胞注释的结果，我们收集了不同T细胞状态的基因集进行基因集富集分析，结果表明我们注释到的细胞类群具有可靠性。总之，我们构建了人类肿瘤TILs中不同功能状态T细胞的单细胞染色质可及性动态变化图谱，揭示了TILs中不同T细胞功能状态的染色质异质性特征。
Figure 2: Single-cell ATAC-seq identifies chromatin states over a wide breadth of human primary CD8+T cell functional states
2. 鉴定了TILs中不同细胞状态组织特异性和共有的基因调控元件
接下来，为了进一步探究不同功能状态T细胞亚群的基因调控元件和转录调控因子。我们从11个T细胞亚群中共鉴定到了200,015个染色质可及性peaks，他们包含了基因启动子和增强子等不同调控区域，差异可及性分析共得到了568,94个细胞类群特异性的peaks。对差异peaks进行转录因子motif富集分析，得到了不同细胞类群特异的转录调控因子。如，在naïve和in vitro activated的T细胞中富集到了TCF motif，在MAIT细胞特异性开放的peaks中富集到了RORgt转录因子，在dysfunctional T细胞中富集到了POU motif。同时，我们还使用chromVAR软件从单细胞水平计算了每个细胞中特定转录因子motif的变异活性。其中，在top100 高变异的TF motif中鉴定到了影响不同T细胞亚群分化，激活和耗竭的特殊转录因子，如AP-1，BATF，NFkB，RORgt，T-bet，Nur77，TCF和NFAT等。UMAP可视化可以看到转录因子RORgt的motif活性在MAIT细胞中最强，TCF的motif活性在naïve细胞中最强，NFkB和Nur77转录因子的活性在Tex细胞的4个cluster中最强。
已有研究表明不同组织内的免疫细胞的染色质状态具有不同的特征，在我们的研究中发现功能障碍的3个T细胞亚群cluster1，2和4主要来源于不同肿瘤组织亚型（cluster1 BCC; cluster2 HCC; cluster4 ccRCC）。为了探究不同肿瘤组织中功能失调T细胞之间的染色质可及性的组织特异性特征，我们对这三个cluster亚群进行了差异分析，得到了6,332个肿瘤组织特异性的差异peaks。对这些差异peaks进行TF motif富集分析，发现了不同肿瘤组织特异性的转录因子，如在BCC-dominated的cluster中富集到bZIP，ETS，NR和POU转录因子，在RCC和HCC-dominated的cluster中富集到T-box和RUNX家族转录因子，在ccRCC-dominated的cluster中富集到NFkB转录因子。
Figure 3: Differential state-specific gene-regulatory cues of human CD8+ T cells states
3. 揭示了肿瘤中耗竭性T细胞功能障碍的核心拟时序分化轨迹
耗竭性T细胞具有一定的异质性，在往终末分化的功能失调过程中存在染色质可及性的重塑。为了探究耗竭性T细胞在功能失调过程中染色质可及性的动态变化特征，我们对传统的CD8+ T细胞进行了亚群重聚类分析，共得到了6个T细胞亚群，分别为cluster1-Tex term，cluster2-Tex prolif，cluster3-Tpex，cluster4-Tmem，cluster5-Tact/heatshock，cluster6-Tcytotoxic。不同功能状态T细胞亚群特征基因的基因活性得分和基因集富集得分的结果，都表明我们T细胞类群注释的准确性。如Tpex细胞亚群中TCF7和CXCR5的基因活性得分较高，Tmem细胞亚群中IL7R, BACH2和LEF1的基因活性得分较高。接下来，我们基于Tpex-Tex term（cluster3-cluster2-cluster1）的分化路径对耗竭性T细胞进行了拟时序分析，可以看到HAVCR2的基因活性在这个分化轨迹中逐渐增强，而TCF7的基因活性则逐渐减弱。同时，我们还发现Tpex细胞在往终末分化的Tex细胞分化的过程中，染色质的可及性、转录因子的TF motif活性和基因活性均处于连续的动态变化中。
Figure 4: A unifying core pathway to terminal dysfunction of human CD8+ TILs
4. 单细胞表观组和转录组整合分析鉴定TILs相关基因的潜在增强子调控元件
接下来，为了进一步探究TILs细胞中特殊调控元件与其靶基因之间潜在的调控关系，我们收集了相应肿瘤TILs细胞的单细胞RNA-seq数据进行整合分析。经批次矫正和多样本整合后，我们得到了38,356个CD8+ T细胞的转录组图谱。细胞降维聚类分群后共得到了9个T细胞亚群，基于不同T细胞亚群特征基因的表达情况进行了细胞功能注释。如cluster1-cytotoxic T细胞亚群中高表达CX3CR1, FGFBP2, FCGR3A, TBX21等，cluster6-cycling T细胞高表达增殖基因MKI67，cluster3-dysfunctional T细胞亚群高表达TOX, ENTPD1, HAVCR2, PDCD1和LAYN基因等，cluster0-Tpex细胞亚群高表达CXCR5, TCF7, CD27和GZMK等基因。接下来，我们对单细胞ATAC-seq和RNA-seq数据进行了整合分析，将scATAC-seq数据中的基因活性与scRNA-seq数据的基因表达进行整合比对，可以看到两种不同测序数据注释到的T细胞亚群之间具有较高的一致性。同时，基于整合的数据我们计算了开放性peaks和基因表达之间的相关性，共得到了49,902个特定的peak-to-gene（PGLs）的互作关系。如EOMES，KLF3，GZMB和IL2RA等基因，可以看到他们的启动子和远处的增强子之间具有较强的共可及性互作关系，这些远程调控元件共同调控着这些基因的转录水平。为了验证这些预测出的promoter-enhancer互作关系的准确性，我们利用已发表文章的promoter-capture HiC数据得到的基因互作关系对他们进行富集分析，结果发现这些预测出的PGLs能够很好的富集到HiC数据的互作loop中。
Figure 5: Integrated single-cell RNA and chromatin accessibility profiling predict enhancer-gene interactions of human tumor infiltrating T cells
5. CRISPRi/a干扰技术验证不同状态T细胞功能特异性基因的增强子元件
超级增强子在决定细胞类型特异性基因的表达调控中发挥着重要作用，他们通常是一连串增强子元件的集合，富集着较强的组蛋白H3K27ac乙酰化修饰信号。为了探究肿瘤TILs中不同T细胞亚群超级增强子的使用差异，我们利用预测出的PGLs关系对每个基因互作peaks的数目累加进行排序，计算排序图的拐点得到不同细胞亚群特异的超级增强子相关基因。如在terminal Tex细胞亚群中鉴定到了TOX, ENTPD1, HAVCR2和CTLA4等基因，在Tpex细胞亚群中鉴定到了TCF7和CXCR5超级增强子相关基因，在cytotoxic T细胞亚群中鉴定到了TBX21, CX3CR1, ZEB2, KLF2和FGFBP2等基因。这些超级增强子相关基因在不同T细胞亚群的功能和分化过程中发挥着重要作用，表明不同T细胞亚群有着各自特异的超级增强子调控元件。为了进一步验证我们鉴定到的增强子-启动子互作关系对关键功能基因表达的调控机制，我们使用CRISPR 激活（CRISPRa）和干预（CRISPRi）技术对关键基因的远程调控增强子元件进行激活和抑制，以探究这些增强子元件对靶基因的调控机制。我们使用CRISPRa技术激活PD1基因下游5kb出的一个增强子元件，流式分析结果表明激活该增强子元件后可以得到更多的PD1阳性的T细胞。同样的，我们还使用CRISPRi技术干预了TCF7基因上游27kb出的一个增强子元件，结果表明干预该增强子元件后TCF7阳性的T细胞显著减少。总之，通过单细胞多组学整合分析，我们鉴定到了不同功能状态T细胞亚群各自特异的关键基因和转录调控元件，并通过CRISPRi/a干扰技术验证了这些远程调控增强子元件对相应靶基因的互作调控关系。
Figure 6: CRISPRi/a validation of cell-state-specific enhancers
总结：
本研究利用改进优化后的单细胞ATAC-seq测序技术构建了不同肿瘤TILs中T细胞的染色质可及性图谱，并解析了不同功能状态T细胞亚群染色质可及性的异质性特征和耗竭性T细胞的组织特异性调控元件及其核心拟时序分化发育轨迹。通过单细胞多组学数据的整合分析，鉴定了不同细胞亚群特异的增强子-启动子互作关系和关键调控靶基因，并利用CRISPRi/a干扰技术验证了这些远程调控增强子元件对相应靶基因的互作调控关系。总之，我们的结果为深入研究T细胞耗竭关键基因的非编码调控元件开辟了新的途径，并为基于CRISPR i/a介导的增强子编辑技术干预T细胞功能和免疫治疗提供了潜力。
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