临近年底了，再过几天，就穷了一年了，不知道是不是该珍惜现在穷的日子，因为以后肯定会更穷的，😄。今天我们来分享一个T细胞方面的研究，当然主要还是针对肿瘤的，参考文章在Pan-cancer single cell landscape of tumor-infiltrating T cells，2021年12月17号发表于science，值得我们深入探讨一下。

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INTRODUCTION

针对肿瘤特异性 T 细胞的癌症免疫疗法使许多癌症患者受益，但不同癌症类型的临床疗效差异很大。 肿瘤浸润性 T 细胞通常会进入功能失调状态，即众所周知的 T 细胞衰竭，效应 T 细胞的抗肿瘤功能受多种因素的调节，包括调节性 T 细胞（T_reg 细胞）的存在。 T 细胞的状态和丰度因不同癌症类型的肿瘤微环境 (TME) 而异，这可能从根本上影响不同的临床参数，例如对免疫疗法的药物反应。

RATIONALE

为了构建高分辨率的泛癌 T 细胞图谱，对来自各种癌症类型的患者的肿瘤、癌旁组织和血液样本进行了单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq)，并收集了其他已发布的 scRNA-seq 数据集。 在校正混杂因素和批次效应后，整合了不同的数据。 该图谱由来自 21 种癌症类型的 316 名患者的 scRNA-seq 数据组成。 将具有基因表达谱的单个 T 细胞的 T 细胞受体 (TCR) 序列组装起来，以表征 T 细胞的扩增和动态。 应用各种计算方法来研究不同癌症类型的 T 细胞的特征和丰度。

RESULTS

在癌症患者中发现了多个潜在的肿瘤反应性 T 细胞 (pTRT) 群体。 pTRTs 的状态在不同癌症类型的肿瘤微环境中变化很大。对于 CD8⁺ T 细胞，主要的 pTRT 是耗尽的 T 细胞并表现出高度的异质性。分别通过效应记忆 T 细胞和组织驻留记忆 T 细胞通过计算推断出 T 细胞耗竭的两条主要发育途径，并且这两种途径在癌症类型中都很普遍。还注意到终末耗竭的 T 细胞和诸如自然杀伤 (NK) 样 T 细胞、17 型 CD8⁺ T 细胞（Tc17 细胞）和 CD8⁺ T_reg 细胞等细胞之间的状态转换，但这种转换往往发生在特定的癌症中类型。对于 CD4⁺ T 细胞，滤泡辅助 T 细胞 (T_FH)/T 辅助 1 (T_H1) 双功能 T 细胞似乎起源于 T_FH 细胞，也是显著的 pTRT 并与肿瘤突变负荷相关。还发现pTRTs 的转录程序可能受到 TMEs 中转化生长因子-b (TGF-b) 和干扰素的影响。 T 细胞状态的丰度因癌症类型而异。根据肿瘤浸润性T细胞组成，可以将癌症患者免疫分型为具有高频率终末耗竭CD8⁺ T细胞组和高频率组织驻留记忆CD8⁺ T细胞组，免疫类型为与临床特征相关，例如患者存活率和对免疫检查点封锁的反应。

Abstract

T 细胞在癌症免疫治疗中发挥核心作用，但我们缺乏对不同癌症类型的肿瘤浸润 T 细胞的异质性和动态的系统比较。 为 21 种癌症类型的 316 名捐赠者构建了一个单细胞 RNA 测序泛癌 T 细胞图谱，并揭示了不同的 T 细胞组成模式。 发现 CD8⁺ T 细胞耗竭的多个状态转换路径以及这些路径在不同肿瘤类型中的偏好。 某些 T 细胞群显示出与患者特性（例如突变负荷）的特定相关性，揭示了肿瘤微环境的可能决定因素。 仅肿瘤内的 T 细胞组成就可以将癌症患者分为具有临床特征特异性的组，为 T 细胞免疫和靶向 T 细胞的精准免疫治疗提供新的见解。

Introduction

肿瘤浸润淋巴细胞 (TILs) 是肿瘤微环境 (TME) 的核心参与者，塑造了基本的临床特性，例如对免疫疗法的反应。免疫检查点阻断 (ICB) 已显示出巨大的临床成功，但其疗效因癌症类型而异，这表明肿瘤免疫存在潜在差异。在 TME 中，效应 T 细胞往往表现出多种抑制性受体的高表达水平，例如 PD-1（程序性细胞死亡 1）、TIM3（T 细胞免疫球蛋白和含粘蛋白结构域的蛋白质 3）、TIGIT（具有 Ig 的 T 细胞免疫受体和 ITIM 域）和 LAG3（淋巴细胞激活 3），它们被认为是功能失调状态的标志，广泛称为 T 细胞衰竭。不同的 ICB 功效可能在逻辑上与癌症类型之间的肿瘤浸润 T 细胞状态差异有关，尤其是耗竭差异。在黑色素瘤患者中，CD8⁺ 肿瘤浸润性 T 细胞表现出从功能障碍细胞状态到功能障碍的线性和连续进展，但在肺癌患者中，有两种可能发展为衰竭的预衰竭状态。因此，各种癌症的 TME 之间的耗竭动态可能不同。从本质上讲，T 细胞耗竭似乎受到多种转录因子 (TF) 的严格调控，包括 TOX（胸腺细胞选择相关的高迁移率群框）和 TCF7（转录因子 7），以及形成在功能失调的 CD8⁺ T 细胞。此外，多种 TME 因素导致耗竭表型，并且在各种癌症类型的 TME 中可能存在决定 T 细胞表型和丰度的不同调节过程。在不同的癌症类型中观察到了可区分的 T 细胞特征。例如，肝癌和结肠癌的 T 细胞耗竭比例高于肺癌，多发性骨髓瘤等癌症类型没有显著的耗竭 T 细胞群。然而，直接比较研究仅限于三四种孤立的癌症类型.

通过单细胞 RNA 测序 RNA 测序 (scRNA-seq) 构建了跨 21 种不同癌症类型的综合肿瘤浸润性 T 细胞纲要。 通过发现肿瘤浸润性 T 细胞的共性和差异，我们旨在揭示 T 细胞状态、动力学和调节的“泛癌”特征。

Result

Construction of a pan-cancer single-cell transcriptome atlas of T cells

表征了 21 种癌症类型的 T 细胞单细胞转录组图谱。经过严格的质量控制过滤后，该图谱包含来自 316 名供体的 397,810 个 T 细胞的数据——来自他们的肿瘤、邻近正常组织和外周血——其中 46.4% 的细胞是在本研究中新测序的，而其他细胞则来自之前发表的数据集。我们在“微型集群”和批次效应校正算法Harmony的基础上，整合了多种技术产生的多样化数据。视觉和定量评估均表明细胞在整合数据中混合良好。来自单个细胞的 T 细胞受体 (TCR) 序列被组装成通过 10x VDJ 和 Smart-Seq2 protocol生成的数据。来自 15 种癌症类型的 87 个供体的 92,533 个克隆型的总共 168,901 个细胞具有至少一对生产性 TCR α 链和 β 链，其中 53.9% 是克隆细胞（在至少两个细胞中发现相同的 TCR 对），对应于 14,631扩展克隆型。

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总共确定了 17 个 CD8⁺ 和 24 个 CD4⁺ metaclusters，所有这些都由至少 80% 的癌症类型共享。这些metaclusters的表达特征分析揭示了先前描述的 T 细胞亚型和新组的存在，包括颗粒酶 K 阳性（GZMK⁺）效应记忆细胞（T_em 细胞）、终末分化的效应记忆或效应细胞（T_emra 细胞），以及CD4⁺ 和 CD8⁺ compartment中的干扰素刺激基因 (ISG) 阳性 T 细胞；杀伤细胞免疫球蛋白样受体 (KIR) 阳性自然杀伤 (NK) 样 T 细胞、ZNF683⁺CXCR6⁺ 组织驻留记忆 T 细胞（T_rm 细胞）和 CD8⁺ compartment中的四个耗尽的 CD8⁺ T 细胞（T_ex 细胞）群；和三个滤泡辅助 T 细胞（T_FH 细胞）相关群体 [CXC 基序趋化因子受体 5 阳性 (CXCR5⁺) pre-T_FH、经典 IL21⁺ T_FH 和 IFNG⁺ T_FH/T 辅助 1 (T_H1) 双功能 T 细胞] 和四个CD4⁺ compartment中的调节性 T 细胞（T_reg 细胞）群。对于CD8⁺ metacluster c16，近一半的细胞具有半不变TCR a链粘膜相关不变T细胞（MAIT），有或没有这种TCR a链的细胞均高表达与17型CD8⁺ T细胞（Tc17细胞）相关的基因，表明该metaclusters包含 MAIT 和非 MAIT Tc17 细胞（以下称为 Tc17）。 (细胞注释的过程大家需要关注一下)。

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未经治疗的患者不同来源组织的T细胞组成表现出显著差异，因为用Shannon equitability index测量的正常组织和肿瘤中的多样性显著高于血液中的多样性（P < 0.01，两侧Wilcoxon 测试），而对于 CD8⁺ T 细胞，肿瘤中的多样性甚至高于正常组织中的多样性。 肿瘤中的 CD8⁺ 细胞以出现衰竭的 T 细胞为特征，而在 CD4⁺ T 细胞群中，最丰富的细胞群是 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞，其在血液和正常组织中的频率均显著降低（P < 0.01，2- 侧威尔科克森检验）。

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为了区分对肿瘤有反应的 T 细胞和旁观者 T 细胞，共同分析了组织分布、转录表型、增殖和克隆扩增的特征。富含肿瘤的 T 细胞的增殖和克隆扩增特征已被视为其肿瘤反应性的证据。从优势比 (OR) 分析来看，幼稚 T 细胞和 T_emra 细胞（CD4⁺ 和 CD8⁺）在血液中表现出强烈的分布偏好，而 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞、T_FH/T_H1 细胞、CD8⁺ISG⁺ T 细胞和四个 CD8⁺ Tex 细胞组似乎富含肿瘤。在 STARTRAC（通过 RNA-seq 和 TCR 追踪进行的单 T 细胞分析）分析的基础上，这种富含肿瘤的metaclusters表现出扩张和持续增殖，暗示它们的克隆扩张是对肿瘤抗原的反应。此外，大多数具有高扩增和增殖指数的富含肿瘤的metaclusters（TCF7⁺ Tex 细胞和 OXPHOS-Tex 细胞除外）往往在 TCR 信号传导中表现出高活性，证实了它们的高抗原反应性。在个体肿瘤水平上，确定了与具有高 TCR 信号或增殖的特定扩增 TIL 共享克隆型的细胞组，这些细胞被统称为潜在的肿瘤反应性 T 细胞 (pTRT)。对于肿瘤中的 pTRT，最常观察到的细胞状态分别是终末 Tex 细胞和 CD8⁺ 和 CD4⁺ T 细胞的 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞，尽管它们的发生率因癌症类型而异。同时，CD4⁺ 和 CD8⁺ compartments的 T_emra 细胞在所有组织中均表现出显著的扩增（P < 0.01，排列测试），但增殖率较低（<2%）。量化组织迁移程度的 STARTRAC 迁移指数显示，在大多数测试的癌症类型中，CD8⁺ 和 CD4⁺ T_emra 细胞在血液与正常或肿瘤组织之间的迁移率最高。这些观察结果表明，这些 T 细胞在肿瘤外被激活和扩增，并在血液中循环。与健康捐赠者相比，癌症患者的血液中含有更多的 CD8⁺ T_emra 细胞。此外，在某些肿瘤中，大多数 pTRT 是 T_emra 细胞。此外，血液中 pTRT 最常见的细胞状态也是 T_emra 细胞，这种模式适用于多种癌症适应症.

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总之，出现了潜在的肿瘤反应性 T 细胞——T_FH/T_H1 细胞、TNFRSF9⁺ T_reg 细胞、CD8⁺ISG⁺ T 细胞和四种 Tex 细胞群，代表了局部抗肿瘤免疫反应——而扩增的 CD8⁺ T_emra 细胞也可能含有肿瘤特定的 TCR，这与全身免疫反应的概念一致.

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Common themes of CD8⁺ T_ex cell heterogeneity and dynamics

在 CD8⁺ compartment中，主要的潜在肿瘤反应性亚群是四个 CD8⁺ T_ex 细胞群，它们都高度表达多种耗竭标志物，包括 TOX、TIGIT、CTLA4（细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4）和 TNFRSF9（TNF 受体超家族 9） ，但它们在基因表达和通路活性方面存在差异。主要群体是末端 T_ex 细胞，其表现出与末端分化相关的基因 ENTPD1（外核苷三磷酸二磷酸水解酶 1）的更高表达。末端 T_ex 细胞还高度表达 IFNG（干扰素-g）和 GZMB（颗粒酶 B），暗示其具有内在的抗肿瘤效应潜力，以及某些在 T 细胞耗竭中具有未知作用的基因，包括 MYO1E（肌球蛋白 IE）和 MYO7A（肌球蛋白 VIIA） .相对稀有的 T_ex 细胞群是 TCF7⁺ T_ex 细胞，其 HAVCR2（甲型肝炎病毒细胞受体 2）和 LAG3（淋巴细胞活化 3）水平较低，但特异表达高水平的 TCF7。 TCF7 被认为是肿瘤中干细胞样 T 细胞的关键调节因子。此外，TCF7⁺ T_ex 细胞高表达 CD200、GNG4（G 蛋白亚基 g 4）、IGFBP4（胰岛素样生长因子结合蛋白 4）、IGFL2（胰岛素样生长因子家族成员 2）和与淋巴结迁移相关的基因 [如作为 CCR7（CC 基序趋化因子受体 7）和 SELL（选择素 L）] .

接下来，结合基因表达和 TCR 数据来剖析 T 细胞耗竭的轨迹。首先，in global，扩散图和 RNA velocyto表明 CD8⁺ T 细胞可以从幼稚 T 细胞发育为 T_emra 或 T_ex 细胞，这与之前的报告一致。其次，对于 T_ex 分支，结合 Monocle3、RNA velocyto和基于均匀流形近似和投影 (UMAP) 和 STARTRAC 成对转换索引 (pTrans) 的图推理，推断出从初始细胞到 T_ex 细胞的两条路径：第一条路径 (P1)通过 GZMK⁺ T_em 细胞 [初始细胞到 IL7R⁺ 记忆 T 细胞（Tm 细胞）到 GZMK⁺ T 细胞到终端 Tex 细胞]，第二个（P2）通过 ZNF683⁺ T_rm 细胞（初始细胞到 IL7R⁺ Tm 细胞到 ZNF683⁺CXCR6⁺ T_rm 细胞）到终端 T_ex 细胞）。在单个肿瘤中也可以观察到从两条路径到 T_ex 细胞的状态转变。尽管某些肿瘤表现出优先使用 P1 或 P2，但在其他肿瘤中，这两条路径的状态转换都很高，这意味着 T_em 和 T_rm 细胞都参与了这些肿瘤的抗肿瘤免疫。末端 T_ex 细胞具有中等 pTrans 和 ISG⁺ T 细胞，而 ISG⁺ T 细胞又与多个metaclsuter高度连接。 ISG⁺状态不是一个独立的状态，而是T_em、T_rm和其他细胞的混合体。此外，包含多种细胞状态的 TCR 克隆型——包括 ZNF683⁺CXCR6⁺ T_rm 细胞或 GZMK⁺ Tex 细胞、ISG⁺ T 细胞和终端 T_ex 细胞——可以在肿瘤中被清楚地识别出来。因为 ISG⁺ 状态代表一种可能由 TCR 触发的干扰素-g (IFN-g) 驱动或由干扰素直接诱导的激活状态，这些观察表明 P1 或 P2 中未耗尽的 T 细胞可能会在进入“耗尽， ”这让人想起在慢性病毒感染中的观察，其中 CD8⁺ T 细胞 - 内在 I 型干扰素信号使分化偏向于更末端的效应状态或衰竭状态。

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假设表达 CXCR5 或 TCF7 的祖细胞产生终端 T_ex 细胞。我们发现 TCF7⁺ T_ex 细胞与 GZMK⁺ T_ex 细胞甚至终端 T_ex 细胞有很强的状态转换连接。一部分 GZMK⁺ 早期 T_em 细胞也表达高水平的 CXCR5 或 TCF7。这些来自 GZMK⁺ 早期 T_em 细胞的 CXCR5⁺ 或 TCF7⁺ 细胞位于 T_emra 或 T_ex 细胞的分支点附近，代表具有不同命运的发育潜力的细胞。相比之下，TCF7⁺ T_ex 细胞更可能代表具有一定干性的定型 Tex 细胞。与 GZMK+ 早期 T_em 细胞相比，来自 TCF7⁺ T_ex 细胞群的那些 CXCR5⁺ 或 TCF7⁺ 细胞具有更高频率的细胞表达 TOX 和抑制性受体，如 PDCD1、TIGIT 和 CTLA4。 TCF7⁺ T_ex 细胞与 GZMK⁺ 早期 T_em 细胞没有强烈的状态转变，但与 NME1⁺（NME/NM23 核苷二磷酸激酶 1）T 细胞高度相关。由于这两种细胞群的稀缺性，TCF7⁺ T_ex 细胞是否源自 NME1⁺ 细胞还有待观察。因此，我们确定了不能单独用 CXCR5 或 TCF7 定义的 T 细胞耗竭路径。总之，我们证明了一种更复杂的 T 细胞耗竭细胞途径。

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Distinct paths to T cell exhaustion across different cancer types

为了检查癌症类型中主要衰竭路径的prevalence，进一步按癌症类型对 TCR 共享进行了分层。 在末端 T_ex 细胞和其他metacluster之间具有强 TCR 共享的 12 种癌症类型中的 11 种中，末端 T_ex 细胞与 GZMK⁺ T_ex 细胞、ZNF683⁺ T_rm 细胞或 P1 或 P2 中的其他metacluster表现出高 pTrans 值， 暗示 P1 和 P2 作为 T 细胞耗竭的通用路径。 我们还观察到，在某些癌症类型中，末端 T_ex 细胞和不在 P1 或 P2 中的metacluster之间存在强烈的 TCR 共享，包括那些在胰腺癌中具有 KIR⁺TXK⁺ NK 样 T 细胞的细胞和在乳腺癌中具有 Tc17 的那些。 这些 TCR 共享模式表明，除了通过 T_em 和 T_rm 细胞的共同路径外，还存在导致 T 细胞衰竭的异质路径。

除了cluster间 TCR 共享之外，终端 T_ex 细胞和其他细胞群之间的发育联系可以通过终端 T_ex 细胞中非耗竭状态的部分特征的表达来证实。卵巢癌的一个终末 T_ex 细胞亚群表达了 T_reg 细胞主导的 TF FOXP3，这些 CD8⁺FOXP3⁺ T 细胞倾向于与表达 CXCL13 的细胞共享 TCR，这意味着 CD8⁺FOXP3⁺ T 细胞和CXCL13 表达细胞。类似地，卵巢癌末端 T_ex细胞的一个子集表达 KIR2DL3（杀伤细胞免疫球蛋白样受体、两个 Ig 结构域和长胞质尾 3）和 TXK（TXK 酪氨酸激酶），它们是 KIR⁺TXK⁺ T 标志基因的一部分。细胞，这些细胞与表达 CXCL13 的细胞共享 TCR。此外，KIR2DL3+细胞的RNA速度指向CXCL13⁺细胞，表明KIR⁺TXK⁺向衰竭转变。这种状态转变也可能发生在其他癌症类型中，因为在多种癌症类型的 Tex 细胞中可以发现表达 FOXP3 的细胞、KIR⁺ T 细胞特征和类似的 TCR 共享模式，尽管它们的频率因癌症类型而异。

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进一步鉴定了末端 T_ex细胞中具有癌症类型偏好的基因，包括 IL26（白介素 26）、IL17A 和 RORC（RAR 相关孤儿受体 C）。这些基因主要在 CD4⁺ TH17 细胞或 CD8⁺ Tc17 中表达。我们证实了它们在 Tc17 中的表达，但在食管癌、鳞状细胞癌和胃腺癌的某些肿瘤中，它们也在一部分终末 T_ex 细胞中表达，尤其是 IL26。此外，包含表达 IL26、IL17A 或 RORC 的 T_ex 细胞的扩增克隆型倾向于包含表达 CXCL13 的 T_ex 细胞，这意味着表达 IL26、IL17A 和 RORC 的细胞与表达 CXCL13 的细胞之间存在状态转换连接。此外，一部分末端 T_ex 细胞表达了半不变的 MAIT 链、衰竭的特征以及 Tc17 的部分特征。因此，似乎有一部分 T_ex 细胞具有分泌 17 型反应细胞因子的能力，这些细胞因子很可能来自 Tc17。这些基因的优先表达——以 IL26 为例，它作为炎症介质，诱导粘膜组织中炎性细胞因子的产生——暗示了 Tex 细胞在某些癌症类型中的多功能特征。

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Universal and cancer type–specific transcriptional regulation of CD8⁺ T cell exhaustion

将 TOX 鉴定为 T 细胞耗竭的关键 TF，激发了人们对寻找其他调节剂的兴趣。我们系统地确定了与耗竭相关的 TF。编码 TF 的末端 T_ex 细胞的特征基因在 > 80% 的癌症类型中具有显著高表达 [效应大小 > 0.15，错误发现率 (FDR) < 0.01，meta-analysis] 被指定为通用 T_ex 细胞调节剂。 TOX、TOX2、RBPJ（免疫球蛋白 k J 区的重组信号结合蛋白）、ZBED2（锌指 BED 型含 1）、PRDM1（PR 域锌指蛋白 1）、VDR（维生素 D 受体）、IKZF4（IKAROS 家族锌）finger 4)、BATF（基本亮氨酸拉链 ATF 样转录因子）、STAT3（信号转导和转录激活因子 3）和 IFI16（干扰素 g 诱导蛋白 16）按效果大小排名前 10 位通用 TF。例如，TOX 在所有癌症类型中都显示出统计学显著性。此外，重建调节子（TF 及其靶基因）的 SCENIC 分析确定了靶向 TOX 的 TF，包括 NR5A2（核受体亚家族 5 A 组成员 2）、ETV1（ETS 变异转录因子 1）和 ARID5B（富含 AT相互作用域 5 B)，其在末端 T_ex 细胞中表现出高调节子特异性，并在 > 50% 的癌症类型中显示出统计学显著性。支持这样的 TOX 调控，使用基底细胞癌的高通量测序 (scATAC-seq) 数据对转座酶可及染色质的单细胞测定进行再分析显示，TOX 启动子或不同基因内增强子中的高可及性峰值终端 T_ex 细胞与这三个 TF 相匹配。尽管 T_em 和 T_rm 细胞的耗竭共享多个上调的 TF——例如 TOX、RBPJ 和 ETV1——指出这些是 T 细胞耗竭的共同驱动力，但不同的耗竭路径在 TF 的使用上也可能不同。例如，BHLHE40（基本helixloop-helix家族成员E40）和ZBTB32（锌指和BTB结构域包含32个）在P1后期出现，而STAT1和IKZF3在P2后期较高。这些观察结果揭示了耗竭的更精细调节过程。

还确定了以前未知的与 T 细胞耗竭相关的关键转录调节因子，包括 SOX4 和 FOXP3。特别是 SOX4，具有高调节子特异性评分，并在所有癌症类型的三分之二中显示出统计学显著性。作为转化生长因子-b (TGF-b) 的下游靶标，据报道 SOX4 在产生 CXCL13 的 TH 细胞中发挥重要作用，并上调 T_reg 细胞中耗竭标志物 ENTPD1 (CD39) 的表达。因此，推断 SOX4 在 T_ex 细胞中发挥了类似的功能，尽管这还需要进一步验证。 FOXP3 同样具有高调节子特异性评分，仅在 47% 的所有癌症类型中显示出统计学显著性。由于 FOXP3 对 T_reg 细胞功能很重要，因此 CD8⁺FOXP3⁺ T 细胞（CD8⁺ T_reg 细胞）与衰竭之间的联系值得进一步研究。表达 SOX4 或 FOXP3 的细胞频率在癌症类型之间显著不同（P < 0.01，Kruskal-Wallis 检验），反映了不同 TME 对 Tex 细胞表型的不同影响。

Properties of potentially tumor-reactive T cells in the CD4⁺ compartment

在 CD4⁺ compartment中，主要的潜在肿瘤反应性metacluster是 IFNG⁺ T_FH/T_H1 和 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞。全局扩散图和 RNA velocyto分析表明，CD4⁺ T 细胞可以从幼稚 T 细胞分别发育为 T_emra 细胞、T_FH/T_H1 细胞或 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞。为了获得更精细的发展轨迹分辨率，分别对每个方向进行了轨迹推断。两个与 T_FH 细胞相关的metacluster显示出从经典的 IL21⁺ T_FH 细胞到 IFNG⁺ T_FH/T_H1 细胞的逐渐转变过程。在这个转变过程中，I 型反应相关的细胞因子和细胞毒性效应分子——包括 IFNG、GZMB 和 PRF1——显著增加（FDR < 0.01，广义加性模型）。此外，TF RUNX3（runt 相关转录因子 3）在出现高密度 T_FH/T_H1 细胞时表现出升高的表达，这与之前的报告一致，即 RUNX3 调节 CD4⁺ 细胞毒性 T 细胞中的细胞毒性表型。 TF TP73（肿瘤蛋白 P73）出现在较早的假时间点，并被鉴定为在 T_FH/T_H1 细胞中具有高度特异性的调节子的调节子。这些观察结果表明在获取和维持 T_FH/T_H1 细胞表型方面的其他关键参与者。

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对于 T_reg 细胞，出现了从 TNFRSF9^- T_reg 细胞到 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞的轨迹，表明从静止状态 (TNFRSF9^- ) 逐渐过渡到激活状态 (TNFRSF9⁺ )。 ISG⁺ T_reg 细胞位于轨迹的中心，表明一部分 T_reg 细胞在激活过程中对 TME 中的 I 型干扰素有反应，这与最近的一份报告一致，表明高 ISG 作为 CD4⁺ T 细胞期间的中间状态特征激活。这种 T_reg 细胞发育轨迹在癌症类型中很常见。在泛癌水平，没有观察到从非T_reg细胞常规T_H细胞明显诱导T_reg细胞，但TNFRSF9⁺ T_reg细胞在一些癌症类型中与非T_reg细胞表现出一定的状态转换电位。例如，TNFRSF9⁺ T_reg细胞在B细胞淋巴瘤中主要与CCR6⁺ TH17和T_FH/T_H1细胞相连，而在子宫体部子宫内膜癌和胰腺癌中则与T_FH细胞相连。因此，各种传统的 CD4⁺ T 细胞群与 Treg 细胞存在转化关系，但这种转化模式因癌症类型而异。

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鉴定了多个先前未发现的 TNFRSF9⁺ Treg 细胞特征基因，包括那些编码具有激酶活性的膜蛋白 [CAMK1（钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 I）和 IGF2R（胰岛素样生长因子 2 受体）]、细胞因子受体 [IL15RA （白细胞介素 15 受体 a）]、已知药物靶点 [IFNAR2（干扰素 a 和 b 受体亚基 2）和 TOP1（DNA 拓扑异构酶 I）]，以及 TFs [TGIF2（TGFB 诱导因子 2 蛋白）和 HIVEP1（HIVEP 锌指 1） )]。 HIVEP1 被推断为 143 个靶基因的关键调节因子，其中大部分也是 TNFRSF9⁺ Treg 细胞的特征基因，包括 TNFRSF4、TNFRSF9、ID3（DNA 结合 3 的抑制剂）、IL21R 和 VDR。 HIVEP1 在 Treg 细胞轨迹的后期加速其表达，这与其他已知的 Treg 细胞 TF（如 FOXP3 和 BATF）在 Treg 细胞轨迹的早期阶段“开启”的模式不同。

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TME shaping the landscape of tumor-infiltrating T cells

检查了与肿瘤中不同 T 细胞组成相关的外在因素。 虽然没有发现每个metacluster的频率与年龄、性别或临床分期之间存在紧密关联，但发现 IL21⁺ T_FH 细胞的频率与体重指数 (BMI) 之间存在很强的关联 [方差比例解释了 ( PVE) > 20%]。 此外，某些metacluster明显表现出组织特异性，支持宿主组织的作用，特别是富含肝脏的 Tc17 细胞.

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癌症类型对 T 细胞群的频率产生广泛的影响，因为观察到不同癌症类型的不同 T 细胞分布模式。 例如，末端 T_ex 细胞的中位频率范围从食管中高丰度（CD8⁺ T 细胞的 26.64%）在多发性骨髓瘤中几乎检测不到癌 (0.15%) [方差分析 (ANOVA) P = 0.00072, PVE 13.1%]。类似地，尽管 TNFRSF9⁺ T_reg细胞的中位频率在所有癌症类型中都很高（> 10%），但癌症类型之间的变异性仍然很高（ANOVA P = 0.003，PVE 13.2%），包括食管癌和头颈癌显示出大约两倍于乳腺癌和胃癌的频率。此外，尽管 TCF7⁺ T_ex 细胞是一个罕见的群体，头颈部鳞状细胞癌显示出最高的中值 (2.63%)，但黑色素瘤样本的一个子集可以达到 12.5% 的频率。此外，尽管 CD8⁺ T_emra 细胞在肿瘤中的代表性不足，但肺癌和黑色素瘤的少数肿瘤样本以及大部分肾肿瘤显示此类细胞的频率要高得多。因此，针对上述细胞亚型的治疗策略应考虑不同癌症类型的变异性。

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肿瘤突变负荷 (TMB) 与 ICB 的疗效有关。 通过将肿瘤分为 TMB 高组和 TMB 低组，我们发现只有 CD4⁺ T_FH/T_H1 细胞的频率与 TMB 显示出强相关性（FDR < 0.001，PVE > 26.3%）。 可以使用bulk TCGA（癌症基因组图谱）数据在泛癌和多种个体癌症类型中验证这种关联。 还确定了 FAT1（脂肪酸转葡萄糖酶 1）突变与 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞之间的正相关。 因此，肿瘤中的 T 细胞组成不仅受 TMB 反映的潜在新抗原数量的影响，还受癌细胞的特定体细胞突变的影响。

为了揭示不同癌症类型的 T 细胞组成的整体模式，检查了肿瘤中metacluster之间的频率相关性，并确定了几个高度相关的metacluster模块。一个模块由三个 ISG⁺ metacluster组成，而四个 CD8⁺ T_ex 细胞群、T_FH/T_H1 细胞和 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞形成另一个模块。具有相似基因特征但来自不同compartments（CD8⁺ Tc、CD4⁺ TH 和CD4⁺ T_reg 细胞）的metacluster倾向于聚集在一起（例如，CD8⁺ Tc17 和CD4⁺ TH17 细胞）。潜在的肿瘤反应性metaclusters与某些metaclusters呈负相关，这可以用几种机制来解释，包括metaclusters之间的动态状态转换。例如，CD8⁺ 末端 Tex metacluster与 CD8⁺ZNF683⁺ T_rm 和 CD8⁺GZMK⁺ T_em metacluster呈负相关，并表现出上述状态转换关系。正相关的metacluster通常在特征基因之间有显著的重叠（P < 0.01，超几何检验），表明相同的调节因子在不同的 T 细胞群中诱导了相似的转录程序。

使用这些重叠的特征基因和 NicheNet 算法来寻找共享配体，我们发现 RORC 和其他 17 型反应相关基因在 TH17 和 Tc17 中可能被 IL23A 和 IL15 等配体诱导。确定了潜在的肿瘤反应性metacluster的共享配体。对于 ISG⁺ metacluster，通过 NicheNet 分析，I 型干扰素编码基因有望被列为顶级配体。对于末端 T_ex、T_FH/T_H1 和 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞，共鉴定了 325 个共享特征基因，其中 18 个是 TF（例如，TOX、TOX2、VDR、ZBED2、ETV7、ZNF282 和 HIVEP1）。因此，三种不同的细胞群可能使用类似的转录机制来响应 TME 刺激。此外，末端 T_ex 和 T_FH/T_H1 细胞均产生 CXCL13 和 1 型反应细胞因子，并且 TGFB1 被推断为诱导其共享特征基因的最佳潜在配体之一。同时，TNFRSF9⁺ T_reg 细胞高度表达 TGF-b 诱导的 TF，包括 SOX4 和 TGIF2。此外，IFNB1 被推断为诱导 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞和末端 T_ex 或 T_FH/T_H1 细胞之间共享特征基因的最有潜力的配体之一。这些观察结果表明，TGF-b 和干扰素可能会影响潜在的肿瘤反应性 T 细胞的转录程序和丰度。

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Immune types of pan-cancer defined by the composition of T cells

接下来，使用这些相关metacluster的频率，发现肿瘤样本可以分为八组（C1 到 C8）。 C1 和 C2 具有高频率的终末 T_ex 细胞，C1 也具有最高频率的 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞。 C3至C8的肿瘤具有低频率的终末T_ex细胞和高频率的CD8⁺ZNF683⁺CXCR6⁺ T_rm细胞，可进一步分为以幼稚T细胞（C7）、富集幼稚T细胞（C8）、富集T_emra为主的组细胞 (C6)、富集的 Tc17 或 TH17 细胞 (C4) 以及低频 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞 (C5)。在线性模型分析的基础上，发现我们的分组可以解释比其他因素更多的肿瘤 T 细胞组成的变异性。尽管每种免疫类型都包括混合癌症类型，但某些癌症类型表现出明显的偏好。例如，近一半的食管癌和鼻咽癌肿瘤属于 C1。相比之下，甲状腺癌和子宫内膜癌富含 C3，表明这两种具有高 T 细胞抑制的癌症类型中的很大一部分可能仍然受益于免疫治疗，因为 ISG⁺ 激活 T 细胞的存在和低丰度的终末期特克斯细胞。超过一半的黑色素瘤属于 C2，其具有高 T_ex 细胞但较低的 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞频率，这与其对 ICB 的反应趋势一致。基底细胞癌和肝细胞癌都富含 C4，表明它们倾向于通过产生 IL17 的 T 细胞引起炎症。这些基于 T 细胞的免疫类型为了解肿瘤浸润性 T 细胞的整体特性提供了参考，这可能有助于指导新疗法的开发和患者分层，而不是传统的癌症类型指标。

这种免疫类型分类可能具有临床意义。使用免疫类型特征对 TCGA 癌症患者进行分层，我们发现 T_ex^loT_rm ^hi（C3 至 C8）肿瘤在跨癌症类型或多种个体癌症类型中具有比 T_ex^hiT_rm ^lo 肿瘤（C1 和 C2）更好的总体存活率，包括肺腺癌、肝细胞癌和肾乳头状细胞癌。由于 T 细胞是许多免疫疗法的直接目标，因此基于 T 细胞的免疫类型在逻辑上可能与治疗效果相关。对已发表的黑色素瘤 PD-1 抗体治疗数据的重新分析表明，响应性肿瘤具有较低频率的终末 Tex 细胞和较高频率的初始 T 细胞。在另一个数据集中复制了 T_ex 细胞连接，表明响应者组比无响应者富含更多的T_ex^loT_rm ^hi肿瘤（Fisher 的精确检验，P = 0.025）。应答者的治疗前肿瘤也具有较高的 Tc17 频率，暗示 Tc17 在 ICB 治疗中的重要作用。需要进一步调查来揭示这一发现与 Tc17 也可能在肿瘤中耗尽的概念有何关联。

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Discussion

系统地表征了来自各种人类癌症的 T 细胞，研究了从基因表达特征和异质性到状态转换和调节的不同方面。 多个富含肿瘤的metacluster——包括 T_ex、T_FH/T_H1 和 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞——值得特别关注，因为它们具有潜在的肿瘤反应性。 我们的分析揭示了 T 细胞耗竭的多种途径以及这些途径的癌症类型偏好。 这种landscope描绘加深了我们对癌症免疫的理解，并将促进治疗发展。

肿瘤中的 T 细胞状态和浸润受到多方面因素的影响，例如肿瘤内在和代谢因素。在数据中，TMB 与 T_FH/T_H1 细胞呈正相关，而 BMI 与 T_FH 细胞呈正相关。因为之前 TMB 和 BMI 都与 ICB 反应有关，我们的研究结果强调了 T_FH 相关细胞群在抗肿瘤反应中的重要性。此外，特定的突变可能会影响 TME 中的 T 细胞组成。 FAT1 突变与 TNFRSF9⁺ T_reg 细胞频率呈正相关。这种关联可能是由癌细胞中的 FAT1-Hippo-YAP1通路功能障碍介导的。肿瘤突变对浸润免疫细胞的影响正在显现，未来可能会积极探索这种联系的机制。此外，我们的研究表明，不同癌症类型的不同 TME 中 T 细胞组成存在显著差异，并提出了一种利用整体肿瘤浸润性 T 细胞特性的免疫分型方案。复杂的肿瘤浸润性 T 细胞特性，我们将在开发可以个性化以实现最大临床益处的未来免疫疗法时获得更好的信息。

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