2023年2月2日，bioRxiv发表了Panagiotis F. Sarris团队题为“The core effector RipE1 of Ralstonia solanacearum interacts with and cleaves Exo70B1 and is recognized by the Ptr1 immune receptor”的研究论文。该论文提出青枯菌的核心效应子 RipE1与 Exo70B1 相互作用并降解Exo70B1，并被 Ptr1 免疫受体识别。https ://doi.org/10.1101/2022.08.31.506019

青枯菌依赖多种毒力因子（也称为效应子）促进多种具有重要经济意义的寄主植物患病。尽管其中一些效应子已被表征，但尚未显示出能够针对宿主的分泌机制。在这里，我们使用 NLR 植物免疫受体整合域 (ID) 的扩展库来识别新的效应靶点。筛选发现，青枯菌核心效应子 RipE1 与拟南芥外囊组件 Exo70B1 相关。RipE1 根据其预测的半胱氨酸蛋白酶活性，在体外裂解 Exo70B1 ，并促进 Exo70B1在植物中降解。RipE1 酶活性还导致 TN2 依赖性异位细胞死亡的激活。TN2 是一种非典型 NLR，已被提议用于保护 Exo70B1。尽管之前有报道称 RipE1 可以激活模型植物物种的防御反应，但我们在此介绍一种烟草物种，其中 RipE1 的表达不会激活细胞死亡。此外，我们发现 RipE1通过其半胱氨酸蛋白酶活性被 Ptr1（一种本塞姆氏烟草CC-NLR）识别。总的来说，这项研究揭示了一个新的 RipE1 靶点和一个新的 RipE1 激活的 NLR，同时为推进 RipE1 和同源效应子的深入研究提供了证据和新工具。

青枯菌是一种破坏性植物病原体，也是青枯病的病原体，影响超过 250 种植物，包括重要的农艺作物 。与许多植物或动物的革兰氏阴性细菌病原体一样，其 III 型分泌系统 (T3SS) 被认为是关键的毒力机制，对于青枯菌在植物组织中成功定殖是必需的。T3SS 对于病原体来说是不可或缺的，因为它负责将 70 多个 III 型效应器 (T3E) 注射到宿主细胞内以促进定植 。

RipE1 是一种 T3E，存在于迄今为止已测序的青枯菌的大多数菌株中，并且似乎在不同的系统型中高度保守。最近的数据表明效应子对毒力的贡献，虽然它似乎触发了本塞姆氏烟草、烟草和拟南芥的植物免疫力，但其他青枯菌T3E 可能能够抑制这些反应。RipE1 已被证明可通过其半胱氨酸蛋白酶活性促进 JAZ（茉莉酸 ZIM 结构域）阻遏物的降解，诱导 JA 信号转导，从而抑制 SA 反应，与早期表征的来自丁香假单胞菌的 RipE1 同源物 HopX1（以前称为 AvrPphE）一致。此外，已知 RipE1 的半胱氨酸蛋白酶活性是触发本塞姆氏烟草和拟南芥免疫反应所必需的。除了催化三联体之外，HopX/AvrPphE 同源物还共享一个保守的 N 末端结构域，即所谓的 A 盒，其功能未知，但显然对于植物中的效应器功能是必需的。对于 RipE1，A-box 结构域也是触发本塞姆氏烟草免疫反应所必需的。

基于结构预测的RipE1细胞内功能

AlphaFold Colab 预测 RipE1 (47.31 kDa) 的 3D 结构（图 1A）。所得结构证实RipE1具有半胱氨酸蛋白酶折叠。半胱氨酸蛋白酶（硫醇蛋白酶）是能够通过酶活性位点中硫醇的去质子化来降解蛋白质的酶。因此，此类中的所有酶都具有共同的催化三联体或二联体，涉及亲核半胱氨酸残基。通过 DALI 在线服务器将预测的 RipE1 结构与蛋白质数据库结构进行比较。与嗜肺军团菌周质蛋白酶 LapG的相似性最高（图 1C）。根据这一比较，RipE1 活性位点处延伸的疏水性表面斑块（图 1B）可能表明其作为底物结合的相互作用界面的作用。随后，两种蛋白质之间的活性位点域的叠加（图1D）具有1.544的均方根偏差（RMSD）。RipE1的催化三联体半胱氨酸-组氨酸-天冬氨酸(CHD)，特别是C172-H203-D222(图1A )，似乎与LapG C137-H172-D189催化三联体(图1D )相同。RipE1 属于 HopX1/AvrPphE 效应家族，其成员共享一个保守的 N 末端结构域和一个具有预测半胱氨酸蛋白酶活性的催化三联体。RipE1 已被证明在体外具有半胱氨酸蛋白酶活性，并且似乎依赖它来裂解 JAZ 阻遏物。利用基于人工智能的结构预测（图1），我们进一步确认RipE1是一种半胱氨酸蛋白酶。这进一步支持了 Sang 等人的发现，他们报道，当属于其催化三联体的半胱氨酸残基被取代时， RipE1 在本塞姆氏烟草和拟南芥植物中失去了其免疫诱导属性。

RipE1 与酵母中的六个 ID 蛋白结构域和拟南芥 Exo70B1 相互作用

为了确定 RipE1 新的假定亚细胞靶标，我们在 RipE1 和 22 个真核蛋白结构域之间进行了酵母双杂交（Y2H）筛选，这些结构域作为集成结构域（NLR-ID）与植物 NLR 融合。我们发现了RipE1 和 NLR-ID 之间总共 6 个相互作用（图 2A ），其中包含大型植物蛋白家族的保守特征域。RipE1 与我们列表中的 TRX 类、WRKY 类、Exo70 类和 CG 类 NLR-ID 相互作用，而 RipE1 与 TFIIS 类、HSF 类和 Ubox 之间也检测到弱相互作用。

为了本研究的目的，我们进一步研究了 RipE1 和 Exo70-ID 之间的相互作用，旨在揭示属于宿主分泌途径的效应靶标。基于我们之前使用 Exo70 样 ID 作为查询进行的 Blastp 分析，我们假设At Exo70B1（一种含有 Exo70 的拟南芥蛋白和植物外囊复合体的组成部分）最有可能是 RipE1 的目标。我们继续测试酵母中 Exo70B1 和 RipE1 之间的相互作用。如图2B所示，Exo70B1不仅与RipE1相互作用，而且还与效应子的两个突变体RipE1-C172A相互作用，在活性位点携带C172A取代，并且发现RipE1 ΔA缺乏8个保守氨基酸(121-128)位于 HopX1 效应器家族的N 末端，也称为 A 盒。这两种突变是根据图 1所示的结构预测设计的，但也是由于之前报道的它们无法在模型植物中诱导植物免疫反应。

RipE1 与At Exo70B1在植物中相互作用

RipE1 已被证明可在本塞姆氏烟草、烟草中引发过敏反应，并在拟南芥中诱导防御反应。在这项研究中，我们筛选了各种烟草物种，包括各种樟子松生态型，为我们的植物内实验寻找新的植物模型。我们发现，当通过农杆菌介导的渗透在我们收集的烟草生态型 NS2706的叶子中瞬时表达时，RipE1 不会触发 HR 反应，因此，我们将其用作一种新工具并进行了所有进一步的研究。

对该生态型的实验。为了测试 RipE1 和 Exo70B1在植物中可能的共定位，我们在烟草叶组织中分别瞬时表达与荧光标签融合的两种蛋白 -YFP 和 -mCherry，通过共聚焦显微镜在 48hpi 观察到。如图3A所示，RipE1和Exo70B1共定位在植物细胞的外围。

BiFC和Co-IP均表明植物中两种蛋白质之间的关联。

此前已证明，在本塞姆氏烟草中，A 盒的删除可消除 RipE1 诱导的细胞死亡。该结构域虽然在 HopX1/AvrPphE 效应器家族中是保守的，但其功能未知，并且较早被提议作为促进效应器-靶点相互作用的结构域。我们的结果表明，删除这个8个氨基酸结构域不会改变RipE1在离体测定中与Exo70B1的物理相互作用能力（图2B ），但它确实消除了其在植物中与Exo70B1结合的能力。

RipE1在体外裂解Exo70B1

为了扩展我们对 Exo70B1 和 RipE1 之间相互作用的理解，我们在计算机中预测并可视化了相互作用（图 4A）。基于此，Exo70B1 146-201 aa 区域似乎接近 RipE1 半胱氨酸蛋白酶的催化三联体。这一观察结果以及两种蛋白质之间的相互作用（图2B、图3）表明Exo70B1是RipE1的底物。为了测试RipE1对Exo70B1的蛋白水解作用，用纯化的蛋白进行体外切割测定(图4B )。将纯化的 6xHis-SUMO3-Exo70B1 与 RipE1-6xHis 一起孵育，添加或不添加半胱氨酸蛋白酶抑制剂亮肽素。每种感兴趣的蛋白质和 6xHis-SUMO3 标签均单独孵育，作为测定的阴性对照。通过SDS-PAGE分析反应，然后进行抗his标签蛋白质印迹分析（图4B）。RipE1 在所有情况下似乎都具有自蛋白水解活性，包括在存在亮肽素的情况下。另一方面，仅在不存在该抑制剂且存在RipE1的情况下才检测到代表切割的6xHis-SUMO3-Exo70B1的条带（参见图4B ，橙色框）（图4B）。

从 Exo70B1 去除 His:SUMO3 标签后，重复体外裂解测定。通过SDS-PAGE分析反应，然后进行银染色（图4C，左）。基于切割的6xHis-SUMO3-Exo70B1(图4B )条带分子量和已去除的His-SUMO3标签，选择三个区域通过质谱法进一步分析，由图4C上的箭头标记。对 MS 衍生数据的分析识别出存在于这些区域中的 Exo70B1 肽，如灰色区域所示（图 4C，右）。这些发现证实Exo70B1在体外被RipE1在特定序列之间切割。

RipE1促进植物中Exo70B1的降解

为了研究植物中RipE1 对 Exo70B1 的可能降解，我们通过农杆菌介导的渗透在樟子松组织中瞬时表达了感兴趣的蛋白质。通过SDS-PAGE和免疫印迹提取和分析蛋白质（图5A），并且总共使用三次重复来对蛋白质条带强度进行计算机定量（图5B）。与体外切割的观察结果一致(图4 )，在植物中短暂共表达后，RipE1的表达似乎以统计学上显著的方式降低了Exo70B1蛋白水平(图5B )。与RipE1在体外对Exo70B1的裂解相比，其在植物体内的降解显得更为严重。这符合以下事实：图 4中所示的体外实验可能并未反映 RipE1 和 Exo70B1 之间相互作用的确切天然条件，而图 5中所示的实验是在植物组织中进行的。

RipE1通过其半胱氨酸蛋白酶活性被本塞姆氏烟草NLR Ptr1a识别

本塞姆氏烟草CC-NLR Nb Ptr1 是 RipE1 半胱氨酸蛋白酶活性激活细胞死亡所必需的。

受保护的 RIN4 不是 RipE1 的直接目标

Nb Ptr1 激活与 RIN4 的裂解相关。基于此，我们决定调查RipE1除了靶向Exo70B1之外是否还靶向RIN4。

我们测试了 RipE1 和 RIN4 之间的潜在相互作用，最初使用 Y2H 测定（图 7A）在体外，并通过 BiFC 测定（图 7B ）在植物中测试。RipE1 不与酵母中的 RIN4 结合（图 7A）。然而，当进行BiFC测定以测试植物中的RipE1-RIN4关联时，在一些细胞中观察到相当弱的YFP信号（图7B）。RipE1-C172A/RIN4关联的信号更强并且在大多数细胞中检测到（图7B）。为了进一步研究 RipE1 靶向 RIN4 的可能性，我们尝试通过 AlphaFold在计算机中可视化这两种蛋白质，就像对 RipE1/Exo70B1 复合物所做的那样（图 4A）。该软件无法以可信的方式预测 RipE1 和 RIN4 之间的复合物，因此该分析的结果是不确定的（数据未显示）。这里提供的数据总体表明RipE1和RIN4在物理上不相互作用（图7A ），但它们在植物中关联并且非常接近（图7B）。

对这些结果的一种可能的解释是，RipE1 可能通过 Exo70B1 降解间接损害 RIN4。2017 年，Sabol 等人报道，在 AvrRpt2 递送后，RIN4 片段和 Exo70B1 都从细胞 PM 释放到细胞质 。尽管这些数据支持 RIN4 完整性对于 Exo70B1 定位到 PM 很重要的假设，但尚未研究在 Exo70B1 降解的情况下 RIN4 定位会发生什么。此外，虽然烟草中 RPM1 异位过度表达会导致细胞死亡，除非 RIN4 也过度表达，但我们的结果表明，樟子松中Nb Ptr1 异位过度表达不会引起细胞死亡（图 6A））。考虑到这一点，Nb Ptr1 可以在没有物理关联的情况下监测 RIN4，从而留下了其他 RIN4 相互作用蛋白（如 Exo70B1）参与该过程的可能性。然而，需要进一步研究以破译RipE1 对Nb Ptr1 的激活，并确定 Exo70B1 降解是否参与该机制。图 8展示了一个描述分子机制的拟议模型，该模型共同整合了本研究的结果。

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