hello，迎来自己在简书创作的第300篇文章，这一篇文章我们做一个单细胞空间组学运用的总结，参考文献在High-Dimensional Single-Cell Transcriptomics in Melanoma and Cancer Immunotherapy，2021年10月发表的一篇review，算是一种简单的总结，我们回顾一下，温故而知新，总结也是一种进步。
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Abstract
单细胞转录组学的最新进展极大地提高了对复杂转录程序的了解，迅速扩展了我们对肿瘤微环境和免疫系统内细胞表型和功能的了解。近年来已经开发了几种新的单细胞技术，使人们能够更深入地了解免疫疗法（例如免疫检查点抑制剂）所针对的mechanistic cells和生物学途径，这些疗法现在通常用于高危早期或晚期患者的管理黑色素瘤。这些技术具有特定于方法的优势、劣势和能力，在利用它们来回答转化研究问题时需要加以考虑。在这里，我们通过审查当前可用的实验和分析工作流程，为单细胞转录组分析平台的实施提供指导。然后，我们强调使用这些技术在接受免疫疗法治疗的癌症患者的背景下剖析肿瘤微环境。讨论了单细胞分析在临床环境中的战略用途，并探索了潜在的未来机会，重点是它们用于使新型免疫治疗药物疗法的设计合理化，最终改善癌症患者的治疗效果。
Introduction
肿瘤由增殖的恶性细胞、免疫细胞、血管和肿瘤基质的复杂混合物组成（下图）。促肿瘤和抗肿瘤信号网络在肿瘤微环境中相互作用以调节肿瘤生长并影响治疗反应。基于免疫检查点的免疫疗法 (ICI)，例如针对免疫调节受体、细胞毒性 T 淋巴细胞相关蛋白 4 (CTLA-4)、程序性细胞死亡蛋白 1 (PD-1) 或其配体、程序性死亡配体的抗体1 (PD-L1)，彻底改变了包括黑色素瘤在内的多种癌症类型的治疗。与历史数据相比，基于现代抗 PD-1 免疫疗法的 IV 期转移性黑色素瘤患者的 5 年总生存率 (OS) 从不到 10% 提高到 50%。尽管有这些改善，约 30-40% 的患者没有反应，还有约 20-30% 的患者最终复发，50% 的患者死于疾病。尽管大量基因组和转录组数据为治疗反应的生物学过程提供了有价值的见解，但对数百万个细胞的信号进行平均会丢失关于可能对确定疾病生物学至关重要的罕见和独特细胞亚型的信息。单细胞分析可以提供独特的机会来更深入地了解驱动免疫治疗反应和抵抗的肿瘤内在和外在机制
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- 注：Single cell sequencing facilitates the dissection of the tumour microenvironment. The tumour microenvironment (TME), including malignant cells, immune cells and stromal cells, regulates a range of cellular and molecular signals. Such signals influence the cell states, tumour proliferation, host immunity and response to systemic therapies. Single cell technologies are providing unique opportunities for dissecting the orchestration of the TME and understanding the tumour-intrinsic and -extrinsic mechanisms of immunotherapy response and resistance.
目前使用免疫组织化学、原位杂交和流式细胞术进行单细胞分析的方法已成为在实验室和临床中检测非恶性细胞和癌细胞之间差异的重要工具。 这些传统方法检查单个细胞并解剖肿瘤中不同的细胞亚型，并补充基于批量的基因组分析。 然而，这种经典方法通常只能检测到有限数量的分析物，这降低了表征 TME 中细胞亚型和分子状态多样性的能力.
单细胞转录组学技术的进步使在许多细胞内以单细胞分辨率以越来越经济的方式无偏见地检测成百上千种分析物成为可能。同样，高度发达的生物信息学工具数量的持续增长使研究人员有机会利用单细胞技术来充分表征不同细胞类型和细胞间相互作用的多样性。分析工作流程包括减少高维数据、邻域聚类、系统发育推断、谱系追踪、伪时间排序、RNA 速度、配体-受体相互作用和多数据集成。此外，基于测序的 mRNA 分子可以通过组织学染色来补充，以进一步整合细胞位置和形态特征。最近对黑色素瘤和其他癌症类型中肿瘤细胞和 TME 的单细胞研究发现了新的细胞亚群、独特的转录程序以及更多关于“肿瘤内”和“肿瘤间”异质性的证据，所有这些都影响了我们的研究。了解治疗反应和耐药性。例如，已经积累了先天免疫抑制细胞（如骨髓源性抑制子亚群）的晚期黑色素瘤对免疫检查点抑制剂的反应很差。此外，功能失调的 T 细胞亚群的不同浸润表现出不同水平的抗肿瘤反应。单细胞方法为回答癌症研究中持续存在的许多临床和生物学重要问题提供了巨大的潜力，包括：TME 和肿瘤异质性对逃避抗肿瘤反应的贡献；治疗过程中T细胞克隆型与肿瘤细胞的时间关系； TME中免疫检查点分子的相互作用网络；以及肿瘤细胞亚型和免疫细胞之间的功能作用和空间关系。在此，我们专注于单细胞技术如何有潜力促进对肿瘤细胞与其微环境之间的相互作用以及对抗癌免疫疗法的反应和抵抗的理解
在这篇综述中，总结了癌症研究中常用的单细胞和空间转录组技术的前景，同时讨论了它们在捕获效率、细胞限制、空间分辨率和分析支持方面的优缺点。 接下来，描述了单细胞技术在新型生物标志物和治疗开发方面的关键发现和潜在应用。 最后，讨论了在医疗保健和临床研究中使用单细胞技术取得的进展。
Single-Cell Transcriptomic Technologies
近年来，出现了一系列广泛的单细胞转录组学技术，并在黑色素瘤和癌症免疫治疗中获得了一系列生物学和临床应用，证明了以无偏见的方式精确表征罕见细胞表型和特定细胞反应的能力。最近的几项研究强调了单细胞转录组学在识别新的潜在分子靶点方面的影响以及检查点抑制剂对肿瘤细胞和 TME 的影响。这些研究充分表征了 TME、T 细胞和免疫抑制细胞状态、转录程序和与疾病进展和治疗反应相关的检查点的细胞组成和功能。单细胞转录组测序技术按其各自的细胞分离方法大致分类（下表）； (i) 液滴封装，(ii) 微孔封装，和 (iii) 荧光激活细胞分选 (FACS)。在本节中，概述了以下单细胞转录组平台，包括 10x Chromium、Fluidigm C1 和 SMART-seq2，这些平台已广泛应用于癌症研究领域，从而提供一个总结指南，可以帮助广泛的生物医学研究人员为他们的单细胞研究做出明智的决定。
Table 1. Specifications of common single-cell sequencing technologies.
| Platform | Company/Academic | Method of Single-Cell Capture | Capture Efficiency | Doublet Rate | Number of Captured Cells | Cell Size Restrictions | Analytical Tool | Advantages | Relative Limitations |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Chromium | 10x Genomics | Droplet encapsulation | 65% | 0.90% | 100–80,000 | Independent of cell size, but generally up to 50 µm | 10x analysis suite including Cell Ranger and Loupe Browser; Seurat R package | Easy to operate; cost effective; intensive support for end-to-end solution; flexible options for multiple applications | High concentration of viable cells required; Little control over cell input |
| DropSeq (Nadia) | Dolomite-bio | Droplet encapsulation | 10% | 1.80–11.3% | 103–104 | None for mammalian cells | Open platform | High throughput; low cost | High concentration of viable cells required; low cell capture efficiency; skills required to operate; minimal support for data processing and analysis. |
| C1 | Fluidigm | Microwell encapsulation | 39% | 3–30% | 96 or 800 | 5–10, 10–17, or 17–25 µm | Fluidigm Singular Analysis Toolset Software | Full-length transcript; customisable workflow (able to exclude empty wells and doublets) | Limited cell capture; low throughput (up to 96 or 800 cells); high cost of cartridges; relatively long preparation time (two runs per day); fresh tissue or cells required |
| ddSeq | Illumina/Bio-Rad | Microwell encapsulation | 3–4% | 5.80% | 103–104 | None for mammalian cells | Illumina BaseSpace or ddSeeker R package | Easy to operate; flexibility of kits for different number of cells; intensive support for end-to-end solution | High concentration of viable cells required; no users modification; single application (RNA-seq) |
| ICell8 | Takara-Bio | Microwell encapsulation | 37% | 1.3–4% | 1800 | 5–100 μm | CELLSTUDIO software | Easy to operate; full-length transcript; customisable workflow (able to exclude empty wells and doublets) | Specialised bioinformatic tools required; single application (RNA-seq) |
| Rhapsody | BD Biosciences | Microwell encapsulation | 65% | 2–10% | 100–40,000 | 5 to 30 μm | BD Rhapsody | Easy to operate; intensive support for end-to-end solution; simultaneously measure protein and mRNA expression; optimise costs based on subsampling and targeted panels | Low sequencing throughput; custom panel of up to 500 targets |
| Smart-Seq2 | Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2,Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types | FACS | 80% | 1% | No limitation | None for mammalian cells | Open platform | No limitations of cell size, shape or homogeneity; simultaneously measure DNA and RNA; high practicality (uses off the shelf reagents); full-length transcript | No options for barcoding and UMI (no multiplexing and gene quantification of samples); laborious worflow due to numerous pipetting steps |
| MARS-Seq | A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications | FACS | 92% | 2% | No limitation | None for mammalian cells | Open platform | Automated process; suitable for rare cell sorting; No limitations of cell size, shape or homogeneity | Specialised bioinformatic tools required |
Droplet Encapsulation Technologies
液滴封装技术、10x Genomics Chromium 和 Dolomite-Bio Nadia 的优势在于能够将大量细胞分选成液滴内的少量单细胞，从而提供高通量和相对低成本的单细胞分析。样品和试剂效率。 Chromium 系统利用 GEM（Gel Bead-in-emulsion）技术，其中凝胶珠的高度多样性池，每个凝胶珠都涂有独特的寡核苷酸条形码序列，与逆转录 (RT) 试剂和油环境中的细胞混合形成数以千计的单个细胞乳液液滴。这种基于 GEM 的 Chromium 仪器可以达到 65% 的细胞捕获效率（即捕获用于下游分析的输入细胞的比例），而双峰率相对较低，仅为 0.9%（两个或多个细胞组合）。此外，在微流控芯片中处理多达 8 个样本，可在 10-20 分钟内捕获 100-80,000 个细胞，并将随后的条形码库汇集起来用于下游测序。除了 10x Chromium 外，还可以使用 Dolomite-Bio Nadia 系统用包被有包含独特分子标识符 (UMI) 序列的寡核苷酸的珠子包裹单个细胞。与基于 GEM 的 Chromium 系统不同，Nadia 系统在从芯片收集液滴后将 RNA 逆转录为 cDNA，在降低 RT 抑制风险方面具有优势。 Nadia 系统还提供带有集成搅拌器的芯片，以确保细胞和珠子在整个运行过程中均匀分布（每次运行 2-8 个芯片中的样品）。然而，与 10x Chromium 系统相比，细胞捕获效率较低，并且 Nadia 仪器需要训练有素的人员来操作运行。这些技术的广泛采用可能会受到测序产生的大量数据的限制，因此这些公司现在正在为之前没有生物信息学经验的生物学家提供端到端的解决方案来处理、分析和可视化单个-细胞表达数据。
Nadia 平台不提供用于数据处理和可视化的软件，并要求用户使用公开可用的管道进行分析。 这可能是生物学家广泛使用和吸收的障碍，因为公开可用的管道需要 R 或 Unix 中的计算技能。 对于 Chromium 和 Nadia 系统，应该考虑对高浓度活细胞的要求，以最大限度地提高液滴中单个细胞的封装吞吐量。 在所有单细胞仪器中，10x Chromium 系统是目前癌症免疫治疗中最流行的单细胞分析平台。
Microwell Encapsulation Platforms
常用的微孔封装平台有 Fluidigm C1、Illumina/Bio-Rad ddSeq、Takara-Bio ICell8 和 BD Rhapsody。在所有微孔技术中，Fluidigm C1系统是最早的一代，被认为是单细胞领域的奠基人。 C1 系统于 2012 年发布，是第一台允许研究人员分离、选择、表型和分选单个细胞的机器，不仅用于全转录组测序，还用于靶向 DNA 或 RNA 测序、全基因组或外显子组测序、small RNA 分析、和表观基因组学。 C1 系统利用集成微流控芯片 (IFC) 将单个细胞隔离到单独的微通道中，从而实现 39% 的细胞捕获效率。尽管包括手动移液和取出细胞在内的工作流程很繁琐，但 C1 仪器允许研究人员在显微镜下目视检查捕获的细胞，将双倍率降低到 3%。由于 IFC 的范围为 5–10、10–17 和 17–25 µm，因此墨盒和试剂的成本可能会大幅增加，尤其是在肿瘤免疫学研究中，因为不同细胞群的细胞大小不同。
与 C1 系统相比，Takara-Bio ICell8 平台在免疫肿瘤学研究中可能更实用，因为 ICell8 使用纳米孔芯片来捕获大小为 5 到 100 µm 的细胞（捕获效率为 37%）。 ICell8 还提供可定制的工作流程，用户可以在其中直观地控制空孔或双联体，并为下游转录组工作选择感兴趣的细胞。 ICell8 应用试剂盒方案提供了不同测序试剂盒（包括 Oxford Nanopore Library Preparation Kit 和 Illumina 全长转录组试剂盒）的灵活性，并兼容使用条形码和 UMI 进行文库构建。
另一个为单细胞工作流程提供灵活性的平台是 Illumina/Bio-Rad ddSeq 仪器。 ddSeq 可扩展试剂盒适用于两种样本量实验，其中一个试剂盒的格式可以处理成百上千个细胞，而另一个试剂盒设计用于处理数万个细胞。 ddSeq 的协议很简单，捕获的细胞被封装到液滴中，用于 cDNA 合成和文库制备以进行测序。 提供了对端到端工作流程的支持，包括生物信息学和用户友好的可视化工具，对于没有经验的用户帮助他们分析和解释单细胞数据很有用。
最近，BD Biosciences 生产的基于微孔的最新仪器 Rhapsody 声称其系统可实现高达 80% 的高单线态捕获效率，具体取决于细胞类型和用户处理。然而，一些研究表明，总体细胞捕获率为 65%，尤其是具有不同细胞类型和大小的样本。 Rhapsody 平台使用 UMI 条形码磁珠在 200,000 个微孔阵列上捕获多达 40,000 个单细胞，并且是一个类似于 Microwell-seq 的基于孔的系统。 Rhapsody 的协议提供对墨盒和微孔的目视检查，以确保样品的质量足以进行下游分析。该工作流程的另一个特点是可以保留剩余的珠子以备后用，从而允许将子样品珠子用于多个文库制备，从而降低测序成本。 Rhapsody 平台可与 BD AbSeq 结合使用，以提供单细胞中蛋白质和 mRNA 表达水平的绝对定量。蛋白质和 mRNA 表达的测量对于理解细胞的复杂调控至关重要，因为大多数细胞表面标志物（如 T 细胞中的 CD4）每个细胞具有数千个蛋白质分子，但仅由少量 mRNA 转录物驱动。转录组学实验中的一个常见问题是 mRNA 表达水平的动态范围。高表达的基因如核糖体基因将在测序运行中主导reads，而低表达的转录本包括免疫基因将稀疏，从而影响准确定量并导致不必要的测序成本。 BD Rhapsody 工作流程为用户提供了一个选项来选择特定的 mRNA 面板（例如，BD Rhapsody 免疫反应面板），并允许富集目标以提供更高的灵敏度，以检测在全转录组分析中可能会遗漏的稀有分子。建议将靶向 RNA 方法用于验证实验，而不是用于发现研究。
Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
除了前面描述的现代单细胞分离技术外，传统的基于 FACS 的单细胞方法，如 SMART-seq2 和 MARS-seq，是实验室中一种成熟且标准化的技术。 SMART-seq2 和 MARS-seq 都将目标群体中的单个细胞分选到含有裂解缓冲液的 96 孔或 394 孔板中，并且在测序前这些板可以保存很长时间。这些技术不受细胞大小或形态或细胞总数的限制，有助于对非常稀有的目标细胞群进行实验。虽然 MARS-seq 的单细胞协议是自动化的，但 SMART-seq2 中的检测需要手动移液到单个孔中，从而使其更加繁琐，并增加了技术可变性。 SMART-seq2 不适合需要数千个单独细胞的实验，除非将液体处理机器人纳入工作流程以减少移液问题。 SMART-seq2 和 MARS-seq 之间的另一个明显区别是 cDNA 合成的长度。 SMART-seq2 生成全长 cDNA 并在整个转录组中产生更高的测序覆盖率，而 MARS-seq 采用 3' 端单细胞 RNA 测序方法，其中部分 cDNA 在逆转录步骤中用条形码和 UMI 标记。与 3' 末端计数 mRNA 相比，全长转录本测序在检测低表达基因和亚型方面具有优势，并允许进行等位基因特异性表达分析。在实验中采用 SMART-seq2 或 MARS-seq 时，用户应注意，基于 FACS 的方法既不提供细胞质量的视觉成像检查，也不提供选择细胞进行下游测序的选项。由于这两种技术通常都需要预先定义的标记，因此稀有亚群的表型需要多种组合的多种不同标记，这有助于更好地识别亚群和下游分析策略。
Spatially Resolved RNA Technologies
绘制完整组织切片中 RNA 分子的亚细胞位置是使用单细胞技术捕捉细胞内功能和生物信号的重要步骤。 这有助于更深入地了解数据和肿瘤生物学，例如了解肿瘤进展和治疗耐药性。 表 2 总结了几种新的高维空间解析 RNA 技术，包括 STARmap、seqFISH、MERFISH、FISSEQ、Slide-seq、Nanostring GeoMx、10x Visium/Spatial 转录组学和高清空间转录组学 (HDST)。 有不同的方法可用 对于空间重新解析的转录组学方法，每种方法的比较已在其他地方进行了广泛的审查。 因此，本节重点介绍这些基于原位捕获的平台的一个子集，这些平台对于癌症研究中的生物标志物和治疗研究变得越来越重要和广泛使用。
NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP)
NanoString GeoMx DSP 平台允许在单个点以 10–600 µm 分辨率对 RNA 和/或蛋白质进行多重分析。该仪器使用标有寡核苷酸条形码的抗体，探针在空间上带有不同 RNA 种类的标签，以从样本组织区域进行转录分析。 GeoMx DSP 依靠荧光标记来视觉引导选定区域，揭示形态（细胞大小和形状）和/或感兴趣的转录物。可以使用 GeoMx 数据中心软件处理、分析和可视化收集到的数据。由于工作流程的稳健性以及对数据可视化和分析的支持，GeoMx DSP 迄今为止已获得更广泛的采用。该技术的另一个关键优势是，与传统的激光捕获显微切割不同，GeoMx 不会导致组织破坏，因此可以重新分析一系列组织切片中的 RNA。由于 GeoMx 旨在在单细胞水平的组织切片中分析用户定义的感兴趣区域 (ROI) 内的综合 RNA 面板的空间表达，因此该平台需要对目标（多达 18,000 个基因）及其相关的先验知识。灵敏度将 ROI 的分辨率限制在 20-200 个细胞的水平。尽管选择 ROI 的工作流程在很大程度上是自动化的，但对整个组织切片的分析是不可行的，这使得无偏的区域分析变得困难。
10x Genomics Visium
10x Genomics Visium 空间基因表达系统采用了空间转录组学 (ST) 概念，将福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 或新鲜冷冻组织成像与高通量测序相结合。该公司通过减少条码间距并将空间分辨率提高到 55 µm 来改进 ST 技术。 Visium 由一个玻璃病理载玻片组成，其中嵌入了带有空间 UMI 和 poly(dT) 锚的探针，允许在透化后在固体表面上结合 poly(A) 尾的 mRNA 分子。逆转录直接在载玻片上原位进行，随后提取 cDNA 复合物用于文库生成和测序。值得注意的是，Visium 检测目前提供用于基因鉴定的 3' RNA 测序。类似于 NanoString GeoMx 平台，用户友好的图形界面软件 (Space Ranger) 可用于数据分析和可视化。 Visium 还允许免疫荧光蛋白与全转录组空间分析的共同检测。尽管 Visium 提供了空间解析的整个转录组数据，但当前直径为 55 µm 的条形码区域可能包含 1 到 10 个细胞。与 NanoString GeoMx 技术类似，Visium 将检测范围限制在给定区域内的几个到数百个细胞。用户应该注意，这可能会在分析 TME 的某些区域时造成一些困难，因为癌细胞经常与免疫细胞和基质细胞的组合相邻。
Slide-Seq
Slide-seq 是最近建立的基于非商业捕获的技术，提供了类似于 10x Genomics Visium 的实验设计，但具有更高的 10 µm 细胞分辨率。 Slide-seq 方法使用一个玻璃盖玻片，其中包含随机叠加的唯一条形码 10 µm 珠子。在样品制备程序之前，通过连接测序原位解码带条形码的珠子的位置。 Slide-seq 技术可用于分析大型组织切片，因为这种方法不受 ROI 的限制。从 Slide-seq 生成的空间转录组数据需要用于计算处理和数据解释的开源工具，因此它需要专门的分析和数据分析专业知识。 Slide-seq 的一个关键限制是，从组织透化到 cDNA 提取用于文库制备的实验过程相对耗时，这导致由于混杂效应而丢失基因表达信息。敏感性降低会影响检测低表达基因的能力，这可能会影响可以研究的生物学问题，特别是与肿瘤内和肿瘤间异质性、罕见免疫亚群以及它们对免疫治疗抗性和肿瘤复发的贡献有关的问题。
High-Definition Spatial Transcriptomics (HDST)
HDST 具有与 Slide-seq 类似的策略，但使用尺寸为 2 µm 的高清空间条形码珠。 每个珠子都包含带条形码的 mRNA 捕获引物，这些珠子使用拆分池方法随机放置在有序的高密度珠子阵列中。 HDST 使用比 Slide-seq 更小的珠子，因此与 Slide-seq 相比具有更好的空间分辨率，从 10 µm 到 2 µm。 HDST 样品制备前的初始方案类似于 Slide-seq，其中珠子的位置通过顺序杂交进行解码。 HDST 的缺点类似于 Slide-seq，包括需要专门的分析和生物信息学专业知识以及 mRNA 捕获的低灵敏度。
Table 2. Specifications of in situ capture spatial transcriptomic technologies.
| Platform | Company/Academic | Detection Efficiency | Resolution | Number of Captured Cells | Sample Type | Analytical Tool | Advantages | Relative Limitations | References |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| GeoMx | NanoString | Not reported | 10–600 μm | 20–200 cells per ROI | Fresh-frozen or FFPE | GeoMx Data Centre Software | Easy to operate (high level of automation); intensive support for end-to-end solution; Ability to profile protein/RNA; single-cell level | Low efficiency of cell capture when using smaller ROIs; Require user-defined ROIs | Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue |
| Slide-seq | Spatially resolved, highly multiplexed RNA profiling in single cells | 0.30% | 10 μm | ~70,000 | Fresh-frozen | Open platform or Seurat R package | Relatively high resolution; scalability; spatial resolution for large tissue volumes | Low sensitivity; minimal support for data processing and analysis | Slide-seq: A scalable technology for measuring genome-wide expression at high spatial resolution |
| Visium | 10x Genomics | >6.9% | 55 μm | 1–10 cells per ROI | Fresh-frozen or FFPE | 10x Space Ranger | Intensive support for end-to-end solution; coverage across a large area of tissue | User-defined regions contain multiple cells | Method of the Year: Spatially resolved transcriptomics |
| High-definition spatial transcriptomics | Highly Multiplexed Subcellular RNA Sequencing in Situ | 1.30% | 2 μm | ~160,000 | Fresh-frozen | Open platform | High resolution | Low sensitivity; minimal support for data processing and analysis | High-definition spatial transcriptomics for in situ tissue profiling |
Dissecting the Tumour Immune Microenvironment Using Single-Cell Approaches
癌症通常始于基因组中的错误，导致正常细胞行为失调并促进恶性表型。不同的转录程序和细胞命运的不同阶段有助于建立肿瘤内异质性 (ITH)，其中同一患者的肿瘤细胞亚群出现在肿瘤的不同区域之间或获得克隆优势并随着时间的推移进化以转移和出现免疫逃逸变异[101]。在转移过程中和在全身治疗的选择压力下，进一步的复杂性被引入到进化过程中。肿瘤必须建立具有脉管系统和基质框架的 TME 以支持其生长，同时通过异常的细胞间和细胞因子信号传导募集调节和免疫抑制细胞以逃避免疫系统。选择压力不仅决定了 TME 的基质和免疫环境，还引发了对肿瘤的选择压力，从而减轻了全身治疗的影响。为了充分了解肿瘤发生、癌症进展和对癌症治疗的反应的生物学，需要研究肿瘤和 TME 进化的动力学及其相互作用。单细胞技术在免疫肿瘤学研究中的应用展示了表征影响黑色素瘤和其他癌症类型免疫治疗反应和耐药性的 TME 特征的潜力，如下表：
Table 3. Translational insights of immuno-oncology in melanoma from single-cell analyses.
| Key Findings | Single-Cell Platforms | Identified Cell Types |
|---|---|---|
| CD8 T cells associated with TCF7 transcription factor were predictive of immunotherapy response; exhausted T cells with abnormal activation of metabolic pathways are correlated with unfavourable prognosis | Smart-Seq2 | CD8+ T cell subtypes (exhausted, naïve and cytotoxic) |
| Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative compartment within human melanoma; the abundance of dysfunctional T cells is associated with tumour recognition | MARS-Seq | Intratumoural CD4 and CD8 T cells |
| B cells and tertiary lymphoid structures promote ICB response and improve patient survival | Smart-Seq2 | B cells |
| Monocyte-derived APCs are central to the response of PD-1 checkpoint blockade and anti-CD40 is a potential novel treatment | Smart-Seq2 | Monocyte-derived dendritic cells |
| Macrophage and γδ T cell subtypes are overrepresented in non-responders to immunotherapy; gene expression signature of these innate cells can help predict treatment response. | Smart-Seq2 and 10x Genomics Chromium | TREM-high macrophages and γδ T cells |
| A cancer-associated transcriptional program promotes T cell exclusion and resistance to checkpoint immunotherapies | Smart-Seq2 | Melanoma cell (resistance signature associated with T cell exclusion and immune evasion) |
| Genetic heterogeneity in Stage III melanoma; coexistence of multiple melanoma signatures within a single tumour region | 10x Genomics Visium | Gene expression profiles of melanoma and lymphoid cells |
| Seven major subpopulations of CD8+ T cells are identified, of which, the exhausted T cell subpopulation is associated with unfavourable prognosis and increased in later-stage melanoma samples, while favourable naïve/memory and cytotoxic subpopulation cells are decreased | 10x Genomics Chromium | 7 representative subpopulations of CD8+ T cells |
Table 4. Translational insights of immuno-oncology of other cancer types from single-cell analyses.
| Cancer Type | Key Findings | Single-Cell Platforms | Identified Cell Types |
|---|---|---|---|
| Breast | Trajectory analysis on longitudinal samples demonstrated distinct T cell states associated with activation, hypoxia and terminal differentiation | 10x Genomics Chromium | CD45+ immune cells (Clusters of T cell, myeloid cell, B cell and NK cell) |
| Tumours with high TILs contained CD8+ T cells with features of TRM T cell differentiation and these CD8+ TRM cells expressed high levels of immune checkpoint molecules and effector proteins; CD8+ TRM gene signature significantly associated with improved patient survival | 10x Genomics Chromium | TREM-specific CD8+ T cells | |
| Cancer associated fibroblast clusters are linked to immunotherapy resistance, promote cancer cell differentiation and T cell exclusion | 10x Genomics Chromium | Cancer-associated fibroblast subsets | |
| Ovarian | Immune-desert tumours demonstrated low antigen presentation and enrichment of monocytes and immature macrophages; immune-infiltrated and -excluded tumours differ markedly in their T cell composition and fibroblast subsets; chemokine-receptor interactions were identified as potential mechanisms mediating immune cell infiltration | 10x Genomics Chromium | Tumour, stromal and immune cells |
| Lung | A high ratio of tumour-infiltrating “pre-exhausted” T cells to exhausted T cells was associated with better prognosis; a gene signature of activated tumour Tregs correlated with poor prognosis in lung adenocarcinoma | Smart-Seq2 | Peripheral blood, peritumoural and intratumoural T cells |
| Liver | Tumour-associated macrophages suppress T cell infiltration in hepatocellular carcinoma and TIGIT-NECTIN2 interaction regulates the immunosuppressive environment; transition of immune cells towards a more immunosuppressive and exhaustive status exemplifies the overall cancer-promoting immune landscape | 10x Genomics Chromium | Tumour and immune cells |
Dissecting Intra-Tumoural Heterogeneity (ITH)
ITH 是导致治疗耐药和癌症进展的主要因素。 致癌性改变的亚克隆变异被假设是某些克隆治疗逃避和随后复发的主要原因之一。 例如，在用激酶抑制剂治疗后会积极选择表达高水平 AXL（受体酪氨酸激酶）的罕见抗治疗黑色素瘤细胞，从而导致耐药性的发展。 此外，少数高度特化的细胞，如类癌干细胞，通常处于静止细胞状态，为肿瘤细胞维持肿瘤生长、转移和抵抗免疫和治疗控制提供了有利的环境。 干细胞样肿瘤表型的特点是 CD133 和 CD44 的高表达，这些细胞还可以通过 WNT 活性上调 PD-L1 和 CD80 来逃避免疫监视，使其对基于免疫的疗法产生抵抗力
单细胞 RNA-seq (scRNA-seq) 平台能够检测肿瘤亚克隆并确定单个细胞之间的转录状态和表型差异。 一个例子是葡萄膜黑色素瘤的 scRNA-seq 研究，其中对原发性和转移性肿瘤进行采样，并通过液滴铬系统处理单个细胞。 使用轨迹分析推断肿瘤和免疫细胞进化过程中的遗传变化，重建转录克隆分支以识别能够逃避免疫的倍性和转录程序的克隆选择。 这些方法在理解治疗选择压力下的免疫疗法耐药性方面具有很大的前景。 治疗患者系统发育树的构建将允许鉴定赋予免疫疗法抗性的不同细胞谱系
Diversity of the Tumour Immune Microenvironment
多组学异质性不仅限于肿瘤细胞。 事实上，作为一种免疫原性癌症类型，各种免疫细胞构成了黑色素瘤的 TME，这对肿瘤进化施加了微环境选择压力，并介导了对某些全身治疗的反应。 通过基因测序对 TME 进行的无偏见探索越来越多地用于研究 TME 以及肿瘤中的细胞相互作用和分子变化。
scRNA-seq 最常见的应用之一是表征肿瘤浸润淋巴细胞 (TIL) 的库和数量。转移性黑色素瘤的 scRNA-seq 分析定义的不同 T 细胞亚群和 TIL 比例与免疫治疗反应和患者预后相关。值得注意的是，代谢途径异常激活的耗竭 T 细胞比例较高与预后不良相关，而幼稚/记忆细胞和细胞毒性 T 细胞比例较高与预后良好相关。在另一项研究中，对来自接受免疫治疗的 48 名黑色素瘤患者的 16,000 多个免疫细胞的转录组谱分析确定了两种不同的 CD8+ T 细胞状态。 CD8+ T 细胞与特定转录因子 TCF7 的关联被确定为反应的预测标志物。此外，李等人。确定了黑色素瘤中功能失调的 T 细胞区室的形成，其中早期效应 CD8+ T 细胞在 TME 内转变为耗竭状态，并且功能障碍特征的强度反映了肿瘤对免疫反应的反应性。相比之下，B 细胞主导的三级淋巴结构的形成被证明可以逆转 T 细胞耗竭并导致肿瘤对免疫检查点抑制剂的反应性提高。在乳腺癌、卵巢癌、肺癌和肝癌的 scRNA-seq 分析中也鉴定了预测性和预后性免疫效应细胞群
最近的研究将免疫细胞异质性的分析扩展到 TME 中的髓源性群体。 发现肿瘤驻留的单核细胞衍生的树突细胞在对抗 PD-1 有反应的黑色素瘤患者中显着富集。 在小鼠模型中用激动剂抗 CD40 抗体靶向这种抗原呈递细胞群导致效应 T 细胞的扩增和抗肿瘤免疫的实施。 接受基于检查点的免疫疗法的黑色素瘤患者的 scRNA-seq 分析还检测到无反应者中 γδ T 细胞和 TREM2+ 巨噬细胞的上调。 通过表征先天免疫细胞，我们对指导抗肿瘤 T 细胞反应的免疫启动有了更深入的了解。
单细胞技术也可用于研究细胞相互作用。 33 个黑色素瘤的 scRNA-seq 询问了促进 T 细胞排斥的恶性细胞状态，并表征了与免疫治疗反应不佳相关的冷免疫生态位的基因组特征。对来自 19 名黑色素瘤患者（包括恶性、免疫、基质和上皮细胞）的 4600 多个细胞进行的单细胞测序显示，TME 极大地影响了黑色素瘤细胞的基因表达程序。对来自 15 个黑色素瘤样本的 2000 个 T 细胞的 T 细胞受体 (TCR) 序列的分析表明，共抑制受体的表达与 T 细胞活化相关，并且在扩增的 T 细胞克隆中富集。该研究还确定了癌症相关成纤维细胞 (CAF)、非恶性基质细胞类型的丰度与肿瘤基因特征的表达之间的联系。此外，发现 CAF 表达的一部分基因会增加 CD4+FOXP3+ 调节性 T 细胞 (Tregs) 的比例，从而形成免疫抑制性肿瘤微环境，从而阻止肿瘤反应性免疫反应。在乳腺癌中也观察到由 CAF 亚型介导的免疫治疗耐药机制，其中 CAF 簇表现出 Treg 中检查点的上调，进而增加了 TME 内其他潜在抑制性 CAF 亚型的丰度。总之，这些研究强调了识别单细胞测序提供的新型免疫治疗靶点的机会。
Use of Single-Cell Analysis to Identifying Biomarkers of Response to Immunotherapies and Novel Drug Targets
研究已经开始使用 scRNA-seq 探索免疫检查点抑制剂的全身作用，以获得对其作用机制的更全面的了解，并确定治疗反应和抵抗的生物标志物。
一种流行的方法是将单细胞 RNA 测序和 TCR 测序配对。循环和肿瘤内 T 细胞的 scRNA-seq 允许定义 T 细胞表型，而 TCR 测序揭示了免疫疗法治疗后血液和 TME 中匹配克隆型的扩展。这种方法已被用于鉴定与治疗反应和耐药性相关的扩增 T 细胞克隆。具体而言，在患者对免疫疗法产生持久反应后，表达共享 TCR 序列的 T 细胞可以作为组织驻留 T 细胞 (Trm) 或效应记忆 T 细胞 (Tem) 存在至少 9 年。这种研究血液和肿瘤中匹配 T 细胞群的方法提供了对免疫治疗反应的细胞机制的新理解。然而，匹配克隆的扩增提示循环T细胞在肿瘤部位外渗，因此不能直接用这种方法识别肿瘤新抗原。
通过将外周免疫细胞表型和临床数据的患者特异性 scRNA-seq 分析相结合，Griffith 等人。提出了一种用动态数学模型估计抗肿瘤免疫攻击程度和预测临床反应的方法。新模型提供了对免疫治疗应答者和非应答者肿瘤生长的免疫调节的见解，证明了外周干扰素信号传导和细胞毒性 T 细胞分化的差异，因此将它们识别为抗 PD-1 反应的外周血指标。该研究能够通过使用来自具有相同治疗方案和样本检索时间点的一组临床试验患者的样本，揭示治疗期间患者特异性反应的演变。外周血样本的时间分析显示，免疫治疗无反应者的 T 细胞丰度较低，治疗后缺乏扩增和效应表型分化。此外，根据宿主免疫系统需要时间来建立抗原识别和发展适应性反应的理论，作者观察到与化学疗法相比，细胞对免疫疗法的反应延迟，这表明发生免疫学变化所需的时间。这突出了时间点选择对免疫治疗研究的重要性，并为未来的研究和临床试验提供了信息。
血液采样是一种非侵入性来源，可用于探索免疫疗法的潜在生物标志物。血液的使用绕过了可能导致肿瘤间异质性的大块组织活检的局限性，同时提供了对全身免疫反应的见解。接受伊匹单抗治疗的黑色素瘤患者的初步报告显示，总体生存期和无进展生存期 (PFS) 的改善与基线常规血细胞计数的外周免疫细胞计数相关，包括低调节免疫细胞频率和高淋巴细胞频率；临床获益还与免疫检查点治疗期间血液标志物的动态变化有关，包括调节性 T 细胞数量的减少和淋巴细胞计数的增加。最近使用液体活检的单细胞基因组研究也揭示了外周 T 细胞亚型的扩增与免疫治疗反应之间的关联；虽然黑色素瘤细胞的 scRNA-seq 确定了对细胞具有抗性的免疫疗法具有转化为 T 细胞排斥机制的突变程序，但一项单独的研究确定了记忆 T 细胞群在对免疫疗法有持久反应的患者中持续了多年。这些研究显示了在具有非侵入性组织来源的免疫治疗应答者中定义全身免疫特性和进化的激动人心的机会。需要未来的前瞻性研究来验证更大队列中临床获益的预测。
空间分辨转录组学方法已被用于研究和可视化黑色素瘤组织切片中 mRNA 的分布。这一新兴领域提供了将感兴趣的细胞表型置于其空间环境中的能力，从而可以分析细胞内通讯和 TME 生态位。 III 期淋巴结黑色素瘤转移中转录景观的可视化确定了不同组织学实体的独特基因表达谱，特别是靠近肿瘤边缘的淋巴细胞的特殊表达模式可能反映了黑色素瘤 TME 的遗传谱。这项技术还提供了对 B 细胞功能状态的新见解，表明三级淋巴结构参与了免疫治疗反应。同样，该技术可用于检测 TME 中配体和受体对的相互作用，随着这些分析分辨率的提高，定位单个细胞及其配体 - 受体配对的能力可以为新型免疫原性的合理化提供重要信息代理。由于成本和吞吐量方面的考虑，这些空间技术尚未广泛用于研究和临床评估。尽管如此，最近的研究结果以及正在进行的技术改进为其未来的应用提供了广阔的前景。
Future Perspectives in Incorporating Single-Cell Analysis into Clinical Trials and Routine Care of Cancer Patients
在现代癌症治疗中，准确的诊断和治疗决策基于原发肿瘤的解剖起源及其具体特征。多年来，流式细胞术和免疫组织化学的单细胞分析已被用于对血液系统恶性肿瘤进行细分。它们是实验室和临床中区分非恶性细胞和癌细胞不可或缺的工具。单细胞转录组学技术提供了一种更强大的方法来广泛表征活检中细胞群的整个分子表型，这可以导致对患者疾病的更准确的诊断和表型分析。例如，科恩等人。采用 scRNA-seq (MARS-seq) 作为 KYDAR 试验（达雷妥尤单抗、卡非佐米、来那度胺和地塞米松 (DARA-KRD) 的单臂前瞻性试验）的一部分。合著者报告说，转录程序和抗性特征已确定MARS-seq 可以帮助预测耐药性并根据患者疾病的特定表型指导治疗选择。尽管迄今为止单细胞转录组学技术尚未用于黑色素瘤临床试验，但 TME 谱和追踪免疫细胞群将为优化治疗选择和验证治疗效果提供蓝图，可能会在未来改善患者管理。
在使这些单细胞平台在临床上更容易获得之前，仍有一些障碍需要克服。 首先，单细胞转录组学和空间数据的高维性需要专门的团队来生成和执行后续的生物信息学分析。 其次，通常需要肿瘤分离的样本收集，尤其是对于 scRNA-seq，通常是有限的并且在逻辑上具有挑战性。 然而，FFPE 样本的空间转录组学正在改进，这可以减轻这些限制。 第三，使用单细胞转录组学平台检测每个细胞中体细胞拷贝数变异的低水平基因表达和转录的能力仍然具有挑战性。 最后，需要降低当前技术的成本和周转时间，以在临床预期范围内运行。
Conclusions
单细胞转录组学发现了新的关键因素和表型改变，它们不仅会促进肿瘤进展，还会导致治疗耐药。 此外，通过单细胞分析鉴定罕见的细胞亚群，为了解治疗的反应和抗性提供了有用的见解。 对于黑色素瘤和其他癌症类型，单细胞转录组学方法为发现与免疫治疗反应和耐药性相关的多维生物标志物特征铺平了道路，并将有助于开发下一代免疫疗法，从而改善生存结果 在癌症患者中。
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