介绍一篇文献：Single-cell analysis reveals new evolutionary complexity in uveal melanoma，2020年发表于Nature Communications，DOI号：https://www.nature.com/articles/s41467-019-14256-1。
葡萄膜黑色素瘤（Uveal melanoma, UM）相比于皮肤黑色素瘤，是一种高度转移性的癌症，检查点免疫疗法在很大程度上无响应。UM根据基因表达谱分为 class 1（中、低转移风险）和 class 2（高转移风险）。 “BSE”突变指BAP1, SF3B1, EIF1AX三个基因的突变，突变近乎相互排斥，分别关联于高转移风险（class 2）、中转移风险（class 1B）、低转移风险（class 1A）。PRAME可作为UM转移的独立biomarker，提示有转移风险的增加。
单细胞RNA测序分析
对8个原发性肿瘤+3个转移性肿瘤，共59,915个单细胞，进行单细胞RNA测序。tSNE降维揭示了肿瘤细胞和非肿瘤细胞的细胞类型多样性。
单细胞CNV分析
利用inferCNV对scRNA-seq数据进行细胞CNV的推断，scDNA-seq加以验证。采用隐马尔可夫和贝叶斯潜在混合模型来确定亚克隆CNV事件，并去除低置信度CNV calls。先前的研究表明，典型基因组改变在 UM 早期出现，并产生与特征驱动突变相关的三个主要进化轨迹之一 —— class 1 A 中的 EIF1AX、class 1B 中的 SF3B1 和其他剪接突变、class 2 中的 BAP1，然而，本研究目前单细胞分辨率的结果表明，这些肿瘤随着迄今未被广泛识别的非典型 CNV 亚克隆的发展会继续发生进化。
转录轨迹分析
利用SCENIC分析scRNA-seq数据，识别潜在的共表达模块，以及与之关联的顺式作用元件。癌蛋白 MYC 和 JUN，以及 bHLH-PAS 缺氧相关转录因子 ARNT，所对应的 motifs 过表达，在 class 2 肿瘤细胞中显著富集。
利用Monocle 2推断转录轨迹，所有肿瘤细胞的伪时序产生总共 16 个状态，分为两个主要分支。然后分别分析每个样本的轨迹，使用分支表达分析模型（BEAM）和层次聚类来识别不同状态所富集的基因。在各样本中识别到 HLA class I 基因、黑色素细胞分化（PMEL）、TNF-alpha/NF-kB signaling（FOS, FOSB, JUN, JUNB, EGR1）的富集，与转录状态不同程度的相关。并且各样本的转录状态分布在不同的亚克隆和细胞周期阶段，印证了表型可塑性（phenotypic plasticity）。
免疫细胞和V(D)J免疫组库分析
肿瘤细胞在转录状态之间的适应性可塑由TME信号驱动。针对免疫细胞进一步细化分析，进行tSNE降维，并根据每个cluster的基因平均表达水平聚类。T和B细胞受体的V(D)J重组分析显示，只有三个样本存在T细胞克隆扩增，是原发 class 2 样本，但它们是耗竭性T细胞克隆扩增。
CD8+ T 细胞表达的与耗竭相关的免疫检查点分子， LAG3 表达最高，TIGIT表达多变，PDCD1 (PD1)、CTLA4、HAVCR2 (TIM3) 和 TNFRSF9 表达极低。多色免疫组化实验进一步验证了这一点。与此同时，肿瘤细胞低表达 PD-L1 和 PD-L2。这可能部分解释了CTLA4 和 PD1阻断在转移性UM中的失效，且提示 LAG3 可能在T细胞衰竭中发挥作用。
讨论
- 推测 class 1 UM 的长潜伏期和低转移率可能是由于免疫监视，至少部分是由于EIF1AX和SF3B1突变产生的新抗原。这种可能性可能具有临床意义，并值得进一步研究。
- 相比之下，推测 class 2 UM 肿瘤的典型基因组改变和整体上的非整倍体增加引起了免疫抑制性微环境，进而通过免疫逃逸促进转移。
- scRNA-seq V(D)J 分析显示在 UM 样本中存在克隆扩增的T细胞和/或浆细胞，表明肿瘤浸润免疫细胞能够产生响应，低突变负荷并不是其对检查点抑制剂响应差的唯一解释。
- LAG3 作为UM中主要的耗竭marker，可以解释（至少部分解释）之前针对CTLA4和PD1的检查点阻断的失败。LAG3是第三种免疫抑制受体，与PD1有相当大的协同作用，不仅在CD8+ T细胞上表达，还在NK细胞和调节性T细胞上表达，具有独特的特性，可以显著扩大检查点抑制剂治疗的疗效。
最后的最后，重温一下Abstract：
【针对讨论的前两点，有些许疑问，实际上根据文献，我们可以得到各个样本各种免疫细胞的占比， class 2 中 CD8+ cytotoxic T cells 和 CD8+ T effector memory cells 的占比明显比 class 1 高出很多，如果是根源上的基因组aneuploidy的原因，按情况应该是产生一个相对“冷”的肿瘤微环境，而非现在所展现的landscape。这种情况大概率是由于抗原的持续存在与刺激，在多种调控因子的作用下致使T细胞逐渐耗竭，进而抑制性受体 LAG3 表达增高（LAG3的表达的确近乎均分布在 class 2 样本中），属于动态的微环境变化，相关线索应该多从转录组和表观基因组着手，个人浅见】。
