影响因子：27.7

研究概述：NK细胞是固有免疫淋巴细胞，能直接杀死病毒感染的细胞，并调控适应性免疫反应的早期阶段，在免疫反应中发挥重要作用。NK细胞通常分为两类：CD56bright和CD56dim，但这种分类过于简化。通过单细胞技术的分析，健康个体中的NK细胞具有高达10万个独特亚群的广泛表型多样性。这种多样性源于随机表达的、胚系编码的激活和抑制受体的组合，这些受体与HLA I类结合，调节NK细胞功能。另一层次的NK细胞多样性是从初始CD56bright NK细胞到终末分化的适应性CD62L−NKG2C+CD57+KIR+CD56dim NK细胞的连续分化，与巨细胞病毒CMV感染有关。在本篇研究中，作者建立了NK细胞单细胞转录参考图谱，解析了血液和正常组织中NK细胞分化期间的基因表达趋势。通过参考图谱分析各种条件下的细胞差异基因，识别出新的NK细胞状态。作者使用来自44,640个PB-NK细胞和27,732个组织驻留TrNKNK细胞的数据，研究了来自427名患者的7种实体瘤中的肿瘤浸润TiNK细胞。发现TrNK和TiNK细胞具有明显的组织驻留特征。在泛癌图谱中，作者确认了六种NK细胞功能状态，其中CD56bright和细胞毒性效应CD56dim状态在多种肿瘤类型中普遍富集。患者生存数据分析显示，效应CD56dim与CD56bright状态的高比例与骨肉瘤和黑色素瘤患者的良好生存相关。这揭示了TME如何导致NK细胞功能障碍，并可能为设计新的NK细胞治疗策略提供灵感。具体结果如下：

研究结果：

NK细胞亚群注释

为了建立一个肿瘤浸润NK细胞的泛癌图谱，作者首先在转录水平上定义了NK细胞的分化。作者对七名健康供体的总NK细胞群体进行了单细胞RNA测序，并整合了五个公开的单细胞数据集成一个均匀的人群（图a）。上文提及CD56bright和CD56dim NK细胞代表两个不同的分化阶段，因此作者基于CD56 bright/ dim signature来对单细胞数据进行评分，以识别CD56bright和CD56dim NK细胞（图b）。CD56dim NK细胞异质性较大的群体通常根据抑制性和激活性受体的选择性表达来表征功能上不同的亚群。因此，为了识别与这些功能阶段相关的预测基因特征，作者从两名供体中分选了相等数量的CD56bright NK细胞和四个CD56dim NK细胞亚群（NKG2A+KIR-CD57-，NKG2A-self-KIR+CD57-，NKG2A-nonself-KIR+CD57-，NKG2A-self-KIR+CD57+或NKG2A-/+self-KIR+CD57+NKG2C+）（图c）。这五个转录上不同的NK细胞亚群被重新命名以反映它们的成熟阶段：‘CD56bright’、‘早期CD56dim’、‘中期CD56dim’、‘晚期CD56dim’和‘适应性CD56dim’（图c）。作者接下来训练了一个半监督模型--scANVI，利用识别的NK细胞亚群基因特征来预测和推断整理的整体NK细胞亚群注释。结果发现，转录上不同的亚群（CD56bright和适应性NK细胞这两个亚群）注释准确性高，而转录重叠较高的亚群注释准确性略低（图d）。使用该模型，作者在亚群水平注释包含12个患者的23,253个单细胞转录组的总NK细胞数据集。scANVI模型捕获了亚群的转录特征，并用于识别差异表达的基因（图e-f）。为了验证这一注释模型，作者又对总NK细胞数据集（12个患者）进行了无偏聚类分析（Leiden），识别了与前面注释的5个NK细胞亚群紧密匹配的5个簇（图g）。部分中期CD56dim注释的NK细胞与晚期CD56dim注释的NK细胞在聚类4中聚集，可能对应于群体中更成熟的细胞（图h）。有/无适应性NK细胞扩展的患者对比中（NK细胞可以在遇到某些病毒感染如CMV后经历适应性扩展），晚期CD56dim和适应性NK细胞亚群的频率也会相应发生变化（图i）。

特定的基因调控网络

为了在转录水平上解析驱动NK细胞分化的调控基因路径，作者使用Palantir和RNA velocity进行了拟时间分析。作者基于最低CD56dim评分定义起始细胞，识别了两个终末期的细胞（橙色），预测属于晚期CD56dim和适应性CD56dim细胞亚群（图a）。作者为了验证这一轨迹，利用scVelo27中的动态模型计算剪接与未剪接RNA速度，在没有预定义类似上面起始细胞的情况下推断拟时间，结果确认了从CD56bright NK细胞亚群开始并终止于适应性CD56dim细胞亚群的轨迹（图b）。既然识别了两种不同的终末期的细胞：晚期CD56dim和适应性CD56dim细胞亚群。作者对这两细胞进一步分析其来源。在两种来源类型中，早期CD56dim NK细胞形成了CD56bright和其余CD56dim亚群之间的连接环节（图c,d）。虽然适应性分化中NK细胞向中期CD56dim细胞进展；常规分化中则转向中期/晚期CD56dim群体（图c,d）。在建立了NK细胞分化的时间轴后，作者利用广义加性模型（GAMs）计算每个基因随时间变化的基因表达趋势，这些基因聚集成五个不同的趋势（图e）。在常规和适应性分化中表达差异的基因（如KLRC2、CD52和IL32）在常规晚期CD56dim分化中聚集于趋势1，在适应性分化中聚集于趋势4（图e）。基于双分化模型，作者构建了按五个基因趋势分层的基因调控网络（GRNs），识别了跨伪时间的主导转录因子（TFs）及其已知的下游靶基因（图f）。趋势1由从CD56bright到CD56dim细胞分化过程中下调的基因主导，包括先前报道的TFs（MYC，LEF1，RUNX2），涉及Notch信号通路的RBPJ，视黄酸受体（RXRA）和调节ID2表达的TFs（HOXA9，HOXA10）。

通过迁移学习生成泛癌图谱

在外周血（PB）中转录定义NK细胞分化后，作者继续使用scVI训练第二个模型M2，结合136名患者的6个健康组织（前列腺、肺、胰腺、皮肤、乳腺、大脑）scRNA-seq数据，生成健康人群的PB-NK + TrNK参考图谱（图a）。使用scANVI对组织特定数据集进行整合和注释，并在泛组织水平（图b）和各个组织内识别感兴趣的免疫亚群。接着，作者对来自427名肿瘤患者患者在泛癌水平（图c,d）和各个肿瘤类型内（包括7个实体肿瘤：前列腺癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤和骨肉瘤）进行注释和整合。为了评估注释NK细胞在组织和肿瘤数据集中的组织驻留状态，作者利用文献中组织驻留特征以及作者自己的图谱衍生出了组织驻留（atlas-TR）NK细胞的特征（图e）。结果发现，相比CD56dim NK细胞，CD56bright NK细胞在正常组织和肿瘤中总体上对组织驻留征评分较高（图e）。最后，作者使用迁移学习（scArches44），将CD56bright和CD56dim注释的TiNK细胞映射到参考图谱（PB-NK，TrNK），生成最终模型（M3）--泛癌NK图谱（图f）。PB、组织和肿瘤中的CD56bright和CD56dim亚群聚集在一起（图g,h）。

不同组织和肿瘤中NK细胞亚群频率的变化

对健康组织和肿瘤注释的免疫亚群进行泛癌比较（图b,d）显示，健康组织的血浆细胞和初始B细胞比例增加，而肿瘤组织的CD56dim NK细胞、单核细胞、树突状细胞、NK T细胞、效应记忆/效应T辅助细胞、效应记忆/再表达CD45RA的细胞毒性T细胞和驻留记忆细胞毒性T细胞的比例减少（图a）。在乳腺癌中，总免疫细胞中CD56bright NK细胞比例增加。而在黑色素瘤中，CD56dim NK细胞比例增加，但在非小细胞肺癌和乳腺癌中比例减少（图a-c）。作者进一步使用第一部分构建好的亚群训练模型（M1）对NK细胞进行亚群水平注释（图d,e）。大多数肿瘤类型（图d,e）中健康组织与肿瘤之间存在CD56bright比例的偏斜，通过流式细胞术在非小细胞肺癌队列中得到同样的验证（图f）。在肿瘤浸润NK细胞（TiNKs）中，中期CD56dim群体普遍减少（图d,e）。对非小细胞肺癌队列CD56dim群体的蛋白质水平注释还发现，与健康血液对照相比，早期和中期CD56dim亚群减少，晚期CD56dim亚群略有增加（图g）。

NK细胞六种功能上不同的细胞状态

作者实施了一种无偏方法（Milo47）通过识别6,932个独立的细胞邻域来确定泛癌NK细胞图谱中的细胞状态。这6,932个邻域被分为6个不同的邻域组，并测试了TiNK细胞和参考NK细胞（Ref-NK细胞）之间的差异丰富度（图a）。邻域组1和2由在TiNK细胞中显著丰富的邻域组成，而组6包括在Ref-NK细胞中丰富的邻域（图b）。接下来，作者使用注释模型（M1）可视化每个组内NK细胞亚群的分布。组1和2富集了CD56bright细胞，而组3-6主要由CD56dim NK细胞亚群组成（图c）。先前识别的PB-NK细胞分化的主导TF调控子确认组1和2为两个CD56bright状态，而组3-6为四个CD56dim NK细胞状态（图d）。接着，作者依据细胞状态特异性GRNs、DEGs、基因集富集分析和特征评分注释了以下的NK细胞状态信息：应激CD56bright（组1）、典型CD56bright（组2）、效应CD56dim（组3）、适应性CD56dim（组4）、活化CD56dim（组5）和典型CD56dim（组6）（图e–n）。比较应激与典型CD56bright状态（组1对组2）发现：ATF3调控子（细胞应激反应）、MAFF调控子（缺氧诱导）和众多热休克蛋白表达增加（图e,g）。应激CD56bright细胞状态在免疫抑制通路（转化生长因子TGFβ信号、缺氧、活性氧ROS）中得分较高，并表现出糖酵解、胆固醇稳态、脂肪酸代谢激活增加（图g,j–l）。此外，低NK细胞细胞毒性评分表明应激CD56bright这一细胞状态功能降低，该状态在所有七种肿瘤类型中普遍表达较高（图m,o）。与TME中CD56bright细胞浸润增加一致，典型CD56bright细胞状态在与健康组织相比的五种肿瘤类型中也表现出丰富度增加，两个CD56bright组均表现出免疫调节分子（如XCL1、XCL2和IFNG）表达增加（图n–o）。在所有肿瘤类型中，CD56dim状态中的效应状态最常见，富集了顶端连接、肌动蛋白和细胞骨架相关基因以及效应分子（图h）。该状态在表型上富集了中期和晚期CD56dim NK细胞亚群，在NK细胞毒性和氧化磷酸化中得分较高，重要的是，在免疫抑制中得分较低（图i,k–m）。活化CD56dim状态的特点是缺氧增加、营养运输蛋白上调和mTORC1–Myc轴上调（图i,k）。最后，典型CD56dim状态表现出低应激评分和高细胞毒性评分，并与IFN、肿瘤坏死因子TNF和JAK/STAT信号相关（图i–j,m）。

TME中特定状态的信号传导与功能的联系

为了阐明TME对识别出的六种功能状态的NK细胞的影响，作者使用CellChat推断细胞间通讯。组1和组2 NK细胞状态在四条主要通讯路径中在所有肿瘤类型中均表现出较强的输入信号（图a）。在非小细胞肺癌中，高表达的CD44、CXCR4和CD74在组1和组2 NK细胞上，大多来自成纤维细胞、内皮细胞、肿瘤细胞和巨噬细胞的信号（COLLAGEN、MIF、LAMININ）汇聚在这些细胞上，促进了输入信号的增强（图b,c）。此外，组1和组2 NK细胞主要通过主要组织相容性复合物I（MHC-I）（HLA-E/KLRC1）通路接收抑制性输入，这归因于这些细胞状态中KLRC1的高表达（图a,d）。因此，组1和组2细胞状态更易接受通过上调的CD44、CXCR4、CD74和KLRC1所介导的TME诱导的免疫抑制信号。为了理解NK细胞如何通过免疫调节作用影响TME，作者将分析重点放在主要由NK细胞进行的输出信号传导上。作者确定了三条信号路径（CC趋化因子配体（CCL）、蛋白酶激活抑制剂（PARs）、IFN-II），通过这些路径，NK细胞主要与树突状细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞进行通讯（图e,f）。效应NK细胞状态（组3）在转录水平上高表达的颗粒酶A可诱导TME中表达F2R的细胞（如成纤维细胞）的凋亡（图g）。与健康血液对照相比，非小细胞肺癌患者的中央肿瘤样本中的CD56dim NK细胞颗粒酶A的表达频率和强度均减少，提示NK细胞在肿瘤内释放颗粒酶A（图h,i）。通过HLA-E轴的抑制信号显著抑制CD56bright和CD56dim NK细胞的脱颗粒和颗粒酶B释放，通过与预先用IFN-γ刺激以上调HLA-E表达的A549靶细胞共培养证明这一点（图j,k）。使用抗NKG2A抗体阻断NKG2A–HLA-E轴，显著恢复了功能，包括脱颗粒和颗粒酶B释放（图j,k）。

细胞状态比例预测患者结局

作者将黑色素瘤SKCM、肺癌NSCLC和胶质瘤GBM的空间RNA测序组织切片进行解卷积，以识别这些数据集中的细胞类型（图a）。SKCM、NSCLC和GBM的主要免疫亚群组成分析在肿瘤类型之间存在很大差异，但在测序技术（scRNA-seq与空间-seq）之间高度一致（图b）。因为NK细胞比例在SKCM最高（图b），作者进一步将注释的NK细胞细分为CD56bright和CD56dim亚群（图c）及细分细胞状态（图d）。效应（组3）和典型（组6）CD56dim状态在与NK细胞毒性相关的基因中得分较高（图e）。类似地，应激反应相关基因及免疫抑制相关基因（ROS，缺氧）在应激CD56bright（组1）状态中得分最高（图f,g）。鉴于在血液、组织和实体肿瘤中的scRNA-seq和空间-seq数据集中识别出的六种功能状态的NK细胞，作者继续测试这些细胞状态的临床相关性，使用包含生存数据的TCGA数据。结果发现较高的效应CD56dim：应激CD56bright NK状态特征比率预测了SARC和SKCM患者的更好生存率（图h）。

研究总结：

本文研究了肿瘤浸润自然杀伤（NK）细胞的泛癌特征及其在肿瘤微环境中的功能。研究通过生成健康人血液和组织来源的NK细胞单细胞转录图谱，分析了肿瘤微环境诱导的扰动。通过将39个数据集中的肿瘤浸润NK细胞转录组整合到参考图谱中，发现了六种功能上不同的NK细胞状态，包括易受肿瘤微环境免疫抑制的功能障碍CD56bright状态和抵抗肿瘤微环境的细胞毒性CD56dim状态。文章揭示了NK细胞在不同分化阶段的特定基因调控网络，并通过迁移学习生成了一个泛癌NK细胞图谱，显示了组织驻留和肿瘤浸润NK细胞的特征。研究表明，不同肿瘤类型中NK细胞亚群频率的变化与患者预后密切相关，效应CD56dim状态的高比例与黑色素瘤和骨肉瘤患者的生存改善有关。这些发现为NK细胞在抗肿瘤免疫中的作用及其作为治疗靶点提供了新的见解。