这篇文献学习笔记分享的是一篇蛋白质复合物共翻译组装的文章。文章于2022年发表在PNAS上。题目是：Cotranslational interaction of human EBP50 and
ezrin overcomes masked binding site during complex assembly

Abstract

多蛋白组合体（蛋白质复合物）是许多生理过程的细胞内主力。成分组装成复合体可以由成熟的折叠蛋白质特异性相互作用的随机，结构域依赖性，翻译后事件驱动。然而，成熟蛋白质中相互作用表面的不可接近性会阻碍复合物的形成。多蛋白复合物成分克服拓扑障碍的机制仍然是个谜。例如，由EBP50和ezrin形成的异二聚体复合物必须解决这个问题，因为ezrin中的EBPP50相互作用域被占据EBP50结合位点的自相互作用所阻碍。在此，作者表明EBP50-ezrin复合物是通过共翻译机制形成的，其中，成熟，完全形成的EBP50的C末端在EZR mRNA翻译过程中结合新兴的，核糖体结合的ezrin的N末端 FERM结构域。与这一观察结果一致，C端EBP50肽模拟物减少了共翻译相互作用并消除了EBP50-ezrin复合物的形成。EBP50在Ser339和Ser340的磷酸化消除了共翻译相互作用并抑制了复合物的形成。总之，作者表明真核mRNA的翻译功能超越了“简单”生成可折叠三级结构的线性肽链并可能用于随后的复杂组装。重要的是，翻译可以促进与空间上难以接近的结构域的相互作用，形成功能性多蛋白复合物。

Results

EBP50和Ezrin的共翻译相互作用

1.相互作用的体内验证：在HEK293T细胞中共表达N端FLAG标记的EBP50和N端His标记的ezrin，用Flag抗体做免疫共沉淀，WB证实了EBP50和ezrin的体内相互作用。
2.相互作用的体外验证：用大肠杆菌纯化重组的全长人N末端6×His标记的ezrin和它的FERM结构域（1-296），并分别固定在Ni2+次氮基三乙酸（NTA）磁珠上。在HEK293细胞中过表达N-FLAG标记的EBP50蛋白，并将细胞裂解物与上述磁珠共同孵育。在洗涤及洗脱后，可以观察到FERM结构域与EBP50之间存在强烈的结合，然而全长的ezrin却未能结合EBP50。

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3.RIP-qPCR实验：N-FLAG标记的EBP50转染HEK293T细胞，细胞在裂解前使用water或Puro处理，用FLAG抗体或IgG抗体做RNA免疫共沉淀实验，最后使用针对EZR mRNA的primer做RT-qPCR。与IgG对照组相比，EZR mRNA呈现100多倍的富集；另一个对照puromycin的处理促进新生肽链的释放，完全破坏了EBP50与EZR mRNA的相互作用。已知PTEN能结合EBP50的N端PDZ1结构域，但FLAG-EBP50的RIP却未能富集PTEN的mRNA，说明它们不以共翻译形式结合。

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EBP50-Ezrin共翻译的特异性和普遍性

1.成熟Ezrin与EBP50的反向共翻译作用：在HEK293T细胞中过表达C-FLAG-tagged ezrin，随后用FLAG抗体进行RIP实验，qPCR结果显示：未能富集到SLC9A3R1 mRNA（编码EBP50）和MSN mRNA（其编码ezrin的异二聚体partener 蛋白moesin）。

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Ezrin N末端和EBP50 C末端是共翻译相互作用必需的

1. ezrin的N末端FERM结构域是一个296个氨基酸的三聚体结构，可与多个伙伴的C末端形成异型相互作用，包括EBP50，CD44，ZCAM-1，ICAM-2。EBP50的30个氨基酸C末端含有EBD，对于结合ezrin的FERM结构域至关重要。首先构建C端缺失30个氨基酸的N端FLAG标记的EBP50，FLAG抗体的Co-IP实验显示N-FLAG-tagged FL EBP50能与ezrin蛋白互作，而EBP50-△C30缺失突变型未能与ezrin蛋白互作。FLAG抗体的RIP实验显示N-FLAG-tagged FL EBP50能显著富集到ezrin mRNA，而EBP50-△C30缺失突变型未能富集到ezrin mRNA。

   
   
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2. 构建N端296个氨基酸FERM结构域缺失的C端FLAG标记的ezrin，随后将N-His-tagged EBP50分别与C-FLAG-ezrin-FL或C-FLAG-ezrin-△N296共转。Co-IP实验显示缺失了FERM结构域的ezrin不能与EBP50互作。RIP-qPCR实验显示EBP50能富集到C-FLAG-ezrin-FL的mRNA，而不能富集C-FLAG-ezrin-△N296的mRNA。

   
   
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EBP50的翻译后修饰调节与Ezrin的共翻译相互作用

1. EBP50的翻译后修饰可调节与Ezrin的共翻译相互作用：EBP50多个位点的磷酸化调节构象及其与伴侣的相互作用。例如，蛋白激酶C（PKC）介导的EBP50 EBD结构域中Ser347和Ser348的磷酸化（相当于人EBP50中的Ser339和Ser340）降低了其与ezrin的相互作用，而且诱导EBP50从质膜重新定位到细胞质。
   2.用CRISPR生成缺失EBP50的HEK293T细胞，然后表达野生型和磷酸缺陷型（S339，340A）N-FLAG-EBP50，并用PMA处理细胞以激活PKC。具有识别双重磷酸化p-Ser339，p-Ser340 EBP50的抗p-Ser-EBP50的免疫印迹显示，在PMA处理的表达野生型EBP50的细胞中EBP50的磷酸化被显著诱导。
   3.如RIP-qRT-PCR显示，PMA显著抑制HEK293细胞中N-FLAG-EBP50与EZR mRNA的结合，表明大量磷酸化介导的共翻译相互作用抑制。然而，PMA并未降低S339，340A突变体EBP50与HEK293T细胞中EZR mRNA的结合，表明PMA作用的特异性。

   
   
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   4.为了证实EBP50的C端EBD的磷酸化直接负责减少共翻译相互作用，构建了带有磷酸化模拟S339,340D残基的带有FLAG标记的EBP50突变体，用FLAG抗体进行蛋白质免疫共沉淀，野生型和S339,340A突变体表现出与ezrin蛋白相当的结合，但磷酸模拟S339，340D EBP50突变体显示出显著降低的相互作用，即使在没有PMA的情况下也如此。

   
   
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Ezrin与EBP50的相互作用维持Ezrin的表达和近膜定位

1.在HEK293T细胞中产生了shRNA介导的ezrin稳定敲低和CRISPR介导的EBP50敲除，WB分析显示ezrin的敲低对EBP50的表达几乎没有什么影响，然而，敲除EBP50适度降低了ezrin的表达。

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2.免疫荧光显示，ezrin在EBP50敲除细胞中的质膜定位减少。多个横截面的定量分析表明，ezrin蛋白的近膜定位减少了约50%，因此，EBP50和ezrin的相互作用有助于后者的表达和质膜积累。

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EBP50 C端肽模拟物消除共翻译相互作用

1. EBP50 EBD 28个氨基酸C端（PEM）被报道能降低EBP50与ezrin的共翻译相互作用。用N-FLAG-EBP50转染HEK293T细胞，并与上游带有9-精氨酸（Arg9）序列的PEM一起孵育以促进膜渗透和带有Arg9的对照EBD含有不结合ezrin的三点突变的肽。用FLAG抗体所做的免疫共沉淀分析显示，与对照肽相比，EBD PEM显著降低了ezrin与EBP50之间的相互作用。RIP-qPCR显示，EBD PEM将共翻译相互作用降低了约10倍左右。

   
   
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   2.通过免疫荧光和免疫印迹发现，HEK293T细胞与Arg-EBD PEM的孵育降低了ezrin的表达及其近膜定位显著降低。