肿瘤免疫微环境/免疫浸润
1. 概念：
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肿瘤及微环境
- 肿瘤细胞
- 肿瘤微环境
- 基质细胞
- 成纤维细胞
- 免疫细胞：B细胞、T细胞等
- 基质细胞
肿瘤免疫微环境：就是肿瘤的内部和周围往往聚集着大量的免疫细胞。这些免疫细胞与肿瘤细胞存在复杂相互作用和调节。
免疫微环境或免疫浸润分析：本质上，就是搞清楚肿瘤组织当中免疫细胞的构成比例。
2. 计算免疫微环境的常用方法：
- “实测法”，高精度的单细胞测序，Single cell RNA-seq等手段。即一个一个细胞去分开测序，把细胞表达都测了，通过一些标记基因，来判断到底这里面有多少类型的免疫细胞，以及每种细胞的构成比例。
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“推测法”，通过bulk RNA-seq进行推测。我们常规的普通RNA测序和芯片结果就是把所有细胞统一裂解抽提RNA，那么检测到的基因表达中，就是各种免疫细胞和肿瘤细胞混杂在一起的表达，通过一些算法，我们可以从这个混杂的表达谱中推断免疫细胞的构成比，常用的软件有CIBETSORT、TIMER、EPIC等等。这些方法大体包括两个思想
- marker gene
- 反卷积思想
3. 免疫浸润分析的常用三种软件：（共有十几种之多）
- CIBERSORT: CIBERSORT 是基于线性支持向量回归（linear support vector regression）的原理对人类免疫细胞亚型的表达矩阵进行去卷积的一个R/网页版工具。多用于芯片表达矩阵，对未知混合物和含有相近的细胞类型的表达矩阵的去卷积分析优于其他方法 (LLSR,LLSR,PERT,RLR,MMAD,DSA) 。该方法是基于已知参考集，提供了22种免疫细胞亚型的基因表达特征集：LM22.
- ssGSEA: ssGSEA允许定义一个富集分数，该分数表示给定数据集内每个样本中基因集的绝对富集程度，ssGSEA是通过R包GSVA去实现的，在分析之前，我们需要安装GSVA包
- ESTIMATE: 来自MD Anderson cancer center的开发者就提出了一种新的算法 --- 与上述CIBERSORT和ssGSEA不同的是：（1）除了免疫细胞，还能分析肿瘤细胞纯度和基质细胞的丰度；（2）关于免疫细胞，仅能计算一个总的免疫细胞评分，而无法给出每种免疫细胞的具体比例。其分析方法其实和ssGSEA有些类似。
4.举例：
作者从GEO数据库（Gene Expression Omnibus）中下载了16个转移瘤相关表达谱芯片数据集。上述374个转移瘤样本，涵盖脑、骨、肝、肺四种转移瘤，其原发肿瘤包括乳腺、结肠、非小细胞肺癌（NSCLC）、肾、前列腺、皮肤黑色素瘤。作者随后对标准化后的数据进行了log2转换，利用sva包进行批次校正，并通过主成分分析（PCA）验证批次校正后的结果。作者利用GEO数据库中的表达谱芯片数据，通过IPS评分、ESTIMATE评分、MCPcounter、quanTIseq、xCell得到转移瘤的免疫微环境特征。
- 通过免疫表型评分（immunophenoscore, IPS）分别计算四种不同免疫表型的评分（抗原呈递、效应细胞、抑制性细胞、检查点），IPS z-score为四者的整合，且IPS z-score越高，样本免疫原性越强。
- 使用ESTIMATE包预测肿瘤纯度并计算肿瘤免疫评分（基质评分、免疫评分、estimate评分），
- 使用MCPcounter包获取免疫细胞浸润具体类型，共包含9种不同免疫细胞（T细胞、细胞毒性T细胞、NK细胞、B系、单核系、髓样树突状细胞、中性粒细胞、内皮细胞、成纤维细胞）
- 使用quanTIseq和xCell对免疫细胞浸润进行再次验证。quanTIseq基于反卷积算法，计算10种肿瘤浸润免疫细胞比例的绝对分数；
- xCell基于标记基因，计算64种免疫细胞和基质细胞相对富集分数。
