不知道大家有没有发现，免疫的研究是单细胞空间的绕不开的话题，其实从我们认知的情况下，免疫细胞受到时空微环境的影响，单细胞识别的T细胞在不同的空间区域也是会有不同的转录图谱，可见，很多的研究都需要结合单细胞空间联合起来进行表征，这一次我们的参考文献在Regional Cell Atlas of Human Intestine Shapes Distinct Immune Surveillance，每次读一些东西，对其认识都会深入一些。
其实关于组织细胞的微环境，单细胞分析得到了大量的表征，但这个分析是建立在损失了空间信息的基础之上，所以对于细胞因位置导致的转录变化无法获得，所以就需要空间转录组的信息所谓补充，但是如果单单从空间转录组出发，精度的问题始终是无法真正克服，也无法得到很详细的表征信息，所以这些研究，都需要结合单细胞空间两种技术，才能真正解决生物学问题。
Abstract
区域肠道免疫监测仍然没有明确的定论。在这项研究中，整合了单细胞 RNA 测序和空间转录组学，创建了一个胎儿和成人肠道区域图谱，由 59 个细胞亚群组成，其中确定了 8 个新亚群和 ILC 过渡态。结果表明，微环境决定了原位细胞分化并塑造了区域分子特征，使不同的肠段具有不同的功能。对mucins、免疫球蛋白和抗菌肽 (AMP) 的区域表达及其在发育和炎症性肠病中的变化进行了表征。值得注意的是， α-defensins在小肠 LGR5+ 干细胞中表达最多，而不是在 Paneth 细胞中表达，并随着细胞成熟而下调。常见的上游转录因子控制着 AMPs 的表达，阐明了上皮分化过程中 AMPs 的并发变化和空间共表达模式。分析证明了risk genes的细胞焦点与疾病位置易感性的对应关系，identified distinct cell-cell crosstalk and spatial heterogeneity of immune cell homing in different gut segments。总体而言，单细胞分辨率转录组的跨时空方法表明，人类肠道的区域环境决定了免疫监视的细胞和分子线索，决定了肠道稳态和疾病。
Introduction
肠道免疫监测对于协调身体与环境之间的营养和免疫至关重要，因为它介导了微生物耐受性和病原体防御。 免疫监视障碍与具有独特区域易感性的疾病有关，例如炎症性肠病 (IBD) 和胃肠道肿瘤。
最近的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 研究为具有区域易感性的疾病期间粘液屏障和免疫细胞的功能障碍提供了新的见解。 然而，肠道微生物免疫监视的区域模式以及支持监视的细胞、分子和细胞间机制仍不清楚。 此外，需要揭示胎儿发育和疾病期间免疫监视的变化。
粘液层、上皮细胞和免疫细胞构成了人体肠道的分级免疫监视。 在本研究中，旨在整合 scRNA-seq 和空间转录组 (ST) 以创建胎儿、健康成人和 IBD 患者的综合肠细胞图谱，以确定上皮细胞分化和功能形成的分子机制。 我们的数据通过描绘免疫监视的区域异质性及其在胎儿发育和 IBD 中的变化，揭示了区域环境在肠道疾病过程中的贡献。
Results
High-resolution cell atlas of the healthy human intestine
总共收集了代表十二指肠、空肠和回肠的 14 个活检样本，并将其分离到上皮或固有层中，并基于 10x Chromium 进行了单细胞转录组测序，从 53,749 个细胞中生成了高质量的转录组。 新生成的profiles与来自健康回肠、结肠和直肠 10,19 的 54 个人类样本（37,821 个细胞）的已发布数据一致，形成了一个涵盖上皮、免疫和 stromal compartments的综合细胞图谱 。
根据compartment-specific，无监督聚类初步将细胞分为六个x compartments，即上皮细胞、T/先天淋巴细胞 (ILC)、B 细胞、基质细胞、单核吞噬细胞 (MNP) 和肥大细胞区室。 基于迭代聚类，确定了59个具有独特基因表达和片段分布的子集，其中8个是新定义的。
New intestinal cell subsets and states
M02-LILRB5+ 巨噬细胞 (LILRB5+CCL3L3+MRC1+CD163+) 在小肠 (SI)，以特定的趋化因子和受体（CCL3L3、CCL4L2、CCR1、CX3CR1 和 C5AR1）为特征，并分散在固有层中，如空间转录组分析所示。 肠道 LILRB5+ 巨噬细胞能够通过 CX3CR1-CCL3L3/CCL4L2 轴进行utative self-recruitment，可能分别通过 CX3CR1 和 CD163 感知细菌代谢物并限制炎症。 M03-CXCL9+ 巨噬细胞 (CXCL9+ CXCL10+) 位于回肠末端和结肠，可能通过 CXCL9/CXCL10-CXCR3 与 cDC1、Th1 样 Trm 和 DP + Th1 样细胞相互作用而与肠道炎症相关。 与 M02 和 M03 相比，M04-CCL18+ (CCL18+) 和 M05-MMP9+ (MMP9+MMP12+PLA2G7+) 巨噬细胞定位于肠道相关淋巴组织 (GALT) 。M05 的传递和分化可能受基质金属蛋白酶 9 和 12的控制。
B05-FCRL4+ 和 B06-CAMP+ 记忆 B 细胞主要位于回肠的 GALT。 B05 中高度表达的趋化因子受体（CCR1、CCR2、CCR6 和 FCGR2A）可能会在炎症期间增强它们的 homing，而由 CAMP 编码的 AMP LL-37 可能会导致 B06 表现出抗菌功能。
正如 RGS5、SOD3 和 GPX3 的上调所表明的那样，一个罕见但独特的亚群 S06-RGS5+ 内皮细胞呈现出缺氧诱导的内皮细胞凋亡的功能状态。 SI 填充的 S05-RSPO3+OGN+ 成纤维细胞表达与 S07-RSPO3+OGN- 成纤维细胞相似的肠道稳态支持基因，其先前已在结肠中鉴定。 然而，S05-RSPO3+ 成纤维细胞上调中性粒细胞和 T 细胞homing趋化因子 CXCL2、3、6，同时下调浆细胞募集趋化因子 CCL7。 值得注意的是，S05 比结肠 S07 表达更高的 C3 和 C7。
NK、ILC1、ILC2 和 ILC3 的谱系特异性基因富集在两个独立的细胞cluster中，即 NK-ILC1 和 ILC2-3。 ILC2-3 子集共表达 ILC2 相关基因 AREG 和 GFI1，以及 ILC3 标记物 RORC 和 IL22。 重新组合 NK-ILC 的尝试失败，以及伪时间分析反映的连续状态，表明 NK-ILC 区室存在过渡状态，并通过荧光激活细胞分选 (FACS) 进一步证实。
Fate decision tree of intestinal cells
构建了一个由 543 个激活的调节模块组成的基因调控网络 (GRN)。 确定了已知细胞类型的conical transcription factor(TF)，例如用于分泌性肠细胞的 ATOH1 和用于 CD4+ 和 DP 型 3 细胞因子 T 细胞的 RORC，以及新确定的细胞类型的 TF，例如用于 FCRL4+ 记忆 B 细胞和 ZNF7 的 POU2F2 LILRB5+ 巨噬细胞。 层次聚类和差异分析发现了决定细胞亚群分化的调节子开关。 例如，SOX17 和 TAL1 分别控制淋巴管和血管内皮细胞的分化，随后激活 MSC 以促进 RGS5+ 内皮细胞的生成。 与整个转录组相反，regulon activity将肠细胞分为相同但连续的细胞谱系。
Shaping of regional epithelial cell differentiation and molecular characteristics by the microenvironment
基于41个独特的GRN和命运决策树，肠的解剖位置深深影响了区域上皮亚群的分化，即SI的GATA4、GATA5和PDX1，以及结肠干细胞的TFCP21、HOXB9和HOXB13， transit-amplifying（ TA) 细胞和未成熟的肠细胞。 然而，不同上皮亚群 GRN 对微环境的敏感性是可变的。 吸收性肠细胞、杯状细胞和 Paneth/BEST4+ 肠细胞在整个肠道中显示出显着的 GRN 异质性，尽管在簇状细胞和肠内分泌细胞 (EEC) GRN 中并非如此。Bile acid receptors NR1H4 and NR1H3 were highly expressed in small intestinal stem cells, TA cells, and immature enterocytes, and less so in mature goblet cells, enterocytes, and Paneth cells, indicating the involvement of environmental signals in epithelial cell differentiation since bile acids differ regionally。
Consistently，伪时间分析显示肠细胞、杯状细胞和 Paneth/BEST4+ 肠细胞的区域异质性高于簇状细胞和 EEC，在细胞分化过程中增加。根据近端 SI、回肠和结肠直肠的局部环境，肠细胞、杯状细胞和 Paneth/BEST4+ 肠细胞显示出明显的功能富集。富含脂肪的近端 SI 中的肠上皮细胞显示与脂溶性维生素消化和吸收途径相关的基因上调，例如维生素 A。与它们在近端 SI 的消化、吸收和代谢途径中的富集相反，回肠肠上皮细胞富含多种免疫相关过程，与回肠中过多的淋巴结构相一致。值得注意的是，基于各种粘液相关基因（如 SPINK4、CLCA1 和 FCGBP 以及粘液相关基因）的上调，肠细胞在粘液生物合成和分泌中向消化道末端汇聚为杯状细胞。代谢途径。远端肠道中富集的杯状细胞和杯状肠细胞可能构成增强的粘液屏障，适应微生物群形状的环境。
Functional epithelial subset differentiation
接下来，研究了受微环境影响的肠上皮功能亚群。成熟的肠细胞、杯状细胞和 Paneth/BEST4+ 肠细胞分别重组为 6、4 和 6 个功能亚群，具有泛肠分布但具有极端的区域异质性。以杯状细胞为例，富含直肠的SET+杯状细胞亚群为早熟，其特点是RNA剪接活跃、mRNA代谢活跃、生长因子反应活跃。 SELENBP1+ 杯状细胞主要分布在结肠中，代表更高的损伤或凋亡，这通过细胞对化学应激的反应和活性氧的解毒作用的增强来揭示。 TFF3+和 TFF1+ 杯状细胞均在粘液形成和微生物防御中起作用。 TFF3+ 杯状细胞在结肠隐窝底部富集，表达增加水平的粘液相关基因（RNASE1、AGR2、TFF3、CLCA1 和 SPINK1）和微生物防御相关基因（ITLN1 和 WFDC2）。然而，主要位于 SI 隐窝顶部的 TFF1+ 杯状细胞上调了 TFF1、FCGBP、ZG16 和 LYPD8 的表达水平，这些表达水平与粘液层稳定性和微生物防御有关。值得注意的是，伪时间分析表明 TFF1+ 子集源自 TFF3+ subsets。
Antimicrobial peptide-mediated regional immune surveillance
对 40 种肠道表达 AMP 的分析表明，大多数 AMP 在不同肠道区域的表达模式不同，例如 SI 和 WFDC2 中的 DEFA5/6、REG3A、REG3G、ITLN2、DMBT1、GBP1、LEAP2 和 H2BC6/7/8 、SLPI、LYPD8、CCL28、ADM、DEFB1、PI3、CCL20、CXCL1、CXCL2、H2BC12/21 和大肠 (LI) 中的 RNASE6。 除 H2BC12 外，SI 和 LI 在远端均显示出较高的 AMP。 此外，AMPs 表达显示细胞特异性，即近端 SI EEC 中的 HAMP、回肠 EEC 中的 TAC1 和近端 SI Paneth 细胞中的 NPY。 值得注意的是，区域特异性 AMP 在特定片段的所有上皮细胞中均有表达，但表达水平不同。 总之，区域和细胞类型特异性 AMP 表达模式似乎塑造了微生物群落。
胎儿肠道的进一步 scRNA-seq 谱表明，AMP 的区域异质性出现在出生前的不同时间点，例如 DEFA5 为 12-13 PCW，LYPD8 为 15-16 PCW，WFDC2 为 12-13 PCW，尽管胎儿 AMP 水平低于成人。
The spatial distribution of AMPs along the crypt-villus axis suggested a unique niche of intestinal stem cells
出乎意料的是，DEFA5/6、REG3A/G、ITLN2 和 PRSS2 在小肠，尤其是近端肠中的表达与 LGR5 呈正相关，并在细胞成熟过程中下降，表明干细胞（而不是表达最高水平的 Paneth 细胞） 溶菌酶编码基因 LYZ) 是某些 AMP 的主要来源，例如防御素。 免疫荧光证实了 DEFA5、PRSS2 和 LGR5 的共表达。 小鼠空肠绒毛的激光捕获显微切割和测序 (LCM-seq) 显示 AMP 在绒毛底部附近富集，这与我们的数据一起表明 AMP 在小肠隐窝 - 绒毛轴的下部富集。 SI 中 AMP 的这种分布模式可能有助于维持肠道干细胞生态位。 相反，正如空间转录组学 (ST) 所揭示的，除了 WFDC2 和 ITLN1，大多数结肠直肠 AMP 在隐窝轴的顶部较高。
此外，ST 分析显示 GALT 中 AMP 的表达有限，其中 CAMP 主要由 CAMP+ 记忆 B 细胞表达，而巨噬细胞产生 HAMP、RNASE6 和 LYZ。 GALT 的关节结构可能解释了独特的 AMP 表达，并有助于杀死被微褶样细胞捕获的病原体。
Transcription factor regulatory network controls the regional expression of antimicrobial peptides
考虑到上皮分化过程中 AMP 的同时变化，以及空间共表达模式，我们假设存在标准的 AMP 上游调节剂。 为了获得机制上的见解，我们生成了 SI 和 LI 特异性 AMP 的转录因子-靶基因网络，证实了 AMP 的常见上游 TF 的存在。 有趣的是，SI AMP，即 DEFA5、DEFA6、PRSS2、REG3G、LEAP2 和 REG3A，受胆汁酸受体 NR1H4 和 NR1H3 的调节，这与 AMP 在 NR1H4 和 NR1H3 依赖性肠干细胞中的大量表达一致， TA 细胞和未成熟的肠细胞。 一致地，回肠中最高的胆汁酸浓度可能导致远端 SI 中 AMP 的表达升高，突出了微环境在先天免疫中的作用。
A shift of AMPs in UC and Crohn’s disease (CD)
在 IBD 患者中已经注意到几种 AMP 的异常表达。 为了描述 IBD 期间的综合 AMP 反应，我们分析了来自 UC 患者的结肠、CD 患者的回肠以及健康对照组的非炎症和炎症活检的 scRNA-seq 数据。 UC患者结肠上皮显示几乎所有AMPs显着上调，包括富含SI的AMPs，如DEFA5/6、REG3A和ITLN2，并且水平随着疾病的进展而升高（健康<非炎症< 炎症）。 相比之下，CD 患者回肠上皮的 AMP 改变显示出不一致的趋势，表明 AMP 在 UC 和 CD 的发病机制中具有不同的作用。 UC 期间增加的 AMPs 可能是对致病微环境的补偿性反应，而即使在 CD 期间内镜炎症出现之前抑制 AMPs 可能会加剧病情。
值得注意的是，UC 患者结肠上皮中表达杯状细胞标志物（MUC2 和 ITLN1）的一组上皮细胞显示出上调的 SI 特异性 AMP（DEFA5、DEFA6、REG3A 和 ITLN2）。 根据杯状细胞亚群的功能分析，产生AMP的细胞是位于隐窝底部的TFF3+杯状细胞（TFF1─LYPD8─）。
Regional heterogeneity of adaptive immune surveillance
ScRNA-seq 数据显示浆细胞主要分布在近端 SI 和结肠，而滤泡 B 细胞分布在回肠，与 Peyer 斑块的富集一致。 IGHA1 和 IGHA2 等 IgA 相关基因在结肠浆细胞中的表达明显高于小肠。 相比之下，IgM 相关基因 IGHM 显示出相反的模式，表明由 IgM/IgA 类别转换介导的区域免疫监视。 与免疫球蛋白合成、加工和分泌相关的基因在 SI 和 LI 之间也存在差异
Regional cores and heterogeneity of intestinal compartment/cell crosstalk
基于受体-配体对的细胞-细胞相互作用和网络表示分析表明，不同compartments中的细胞 - 细胞串扰代表了compartmentalization and de-compartmentalization的共存。 上皮细胞、成纤维细胞和髓细胞compartments（即compartmentalization）内显示更强烈的交流强度，而 T/ILC、B、神经胶质和内皮细胞被de-compartmentalization。 在compartment/细胞串扰的强度中观察到显着的区域异质性（回肠 > 近端 SI > 结肠），表明 CD 以回肠为主，其特征是透壁炎症、穿透性和纤维化狭窄，与 UC 的黏膜局限性。 SI 中室间串扰的核心由单核细胞、巨噬细胞和基质细胞组成，而 LI 由 MNP 和上皮细胞组成。
Molecular basis of intestinal immune cell homing
趋化因子-受体对构成了免疫细胞竞争homing的分子基础。 结果证明，同一谱系表现出免疫细胞募集的区域特异性能力，从而导致免疫细胞的空间分布。 例如，上皮中 CXCL1、2 和 3 的增加，以及它们向远端消化道的成纤维细胞减少，表明中性粒细胞可能在 SI 中固有层成纤维细胞附近富集，但被募集到结肠上皮。
确定了区域特异性趋化因子，例如 SI 上皮中已知的 CCL25 和新发现的 SI T 细胞、NK-ILC1 和 MNP 中的 CCL3L3 和 CCL4L2。 预测了新的相互作用，即 GPR42-CCL4L2 介导的肥大细胞-T 细胞/NK-ILC1 相互作用，CX3CR1 介导的 LILRB5+ 巨噬细胞和 CXCL9+ 巨噬细胞归巢至表达 CX3CL1 的成纤维细胞和内皮细胞，以及 CCR4 介导的 Treg homing至 CCL22 表达 LAMP3+ DC。 此外，除了幼稚T细胞、滤泡B细胞和肥大细胞外，所有免疫细胞谱系都存在自我招募的正反馈。
Mapping cellular and regional foci of intestinal diseases
全基因组关联研究 (GWAS) 确定了肠道疾病的风险等位基因。我们确定了所有 59 个细胞亚群中 9 种疾病的 85 个风险基因的表达，以确定疾病的细胞起源，例如 ILC2-ILC3 中的 CD 风险基因 IL23R 和 MMP9+ 中的食物过敏 (FA) 风险基因 MMP12 和 STXBP6分别是巨噬细胞和肥大细胞。基因集富集分析表明在特定谱系中富集了疾病风险基因。例如，CD、UC、内部结核病和乳糜泻风险基因在MNPs中富集，FA基因在肥大细胞、内皮细胞和滤泡B细胞中富集。与免疫细胞紊乱相关的多种疾病表明异常免疫监视在肠道疾病的发生中起着至关重要的作用。我们进一步研究了五种疾病的细胞和区域易感性，其风险基因在免疫区室中富集，与流行病学特征一致。根据区域趋势，CD风险基因SNX20、CARD9、IL27和PRDM1在回肠CXCL9+巨噬细胞中富集，IL10在回肠FCN1+单核细胞中富集。 TB 风险基因、TAB3、MICB、TAP2 和 C6orf47 富含回肠 S100A8+ 单核细胞。
Discussion
提出了一个跨肠道空间的综合细胞和空间图谱，由 59 个细胞亚群组成，其中 8 个是新发现的。 具有独特基因表达、片段分布和空间定位特征的新亚群与炎症进展和微生物防御有关。 确定了 ILC 的过渡状态，这意味着潜在的极化及其对肠道疾病的影响。
该图谱提供了对环境调节的上皮分化和区域分子和功能特征的新见解。 通过GRN分析表明解剖位置对于区域上皮亚群的分化至关重要。 不同上皮细胞 GRN 对微环境的敏感性似乎是可变的
确定了整个发育和成年期间 AMP 介导的免疫监视的区域和空间异质性，表明 SI 和 LI 之间存在高度可变的 AMP 模式，这可能与塑造 SI 和 LI 的不同微生物群落有关。 确定了 AMP 在不同区域的干细胞生态位维持中的独特作用。 AMPs 集中在 SI 的隐窝底部，但主要位于结肠隐窝的顶部。 SI和LI AMPs空间分布的这种差异可能符合粘液层的独特结构，需要进一步研究 。
分析的数据显示，SI 中的 LGR5+ 干细胞，尤其是近端，表达最高水平的 SI 特异性 AMP，以 DEFA5/6 为代表。这一结果令人惊讶，因为肠上皮衍生的微生物防御机制过去主要归因于Paneth cells。一项小鼠研究可能将我们数据中的这些 LGR5+ 细胞反映为致力于成熟为分化的分泌细胞的前体。常见的上游 TF 控制 SI 和 LI 中的 AMP，阐明了上皮分化过程中 AMP 的同时变化，以及空间共表达模式。值得注意的是，胆汁酸受体 NR1H3/4 参与调节 SI 特异性 AMP 的表达，强调环境信号参与 AMP 介导的肠道免疫监视，并与胎儿发育过程中逐渐建立的区域 AMP 模式一致，因为大约 17 PCW 是胎儿胆汁分泌开始的关键窗口。有趣的是，隐窝底部的杯状亚群导致了 UC 期间防御素的上调，而不是之前认为的Paneth cells metaplasia。
此外，风险基因的细胞焦点与疾病位置易感性的对应关系，以及不同肠道段中不同的细胞间串扰和免疫细胞的空间异质性，为肠道疾病中区域环境决定的免疫监视提供了新的见解。 总的来说，我们的数据揭示了人类肠道的区域环境决定了免疫监视的分子线索，决定了肠道稳态和疾病，这可能会为人类医学带来借鉴。
Methods（关注一些重点方法）
Graph clustering and partitioning cells into distinct compartments（scanpy的分析）
Estimation of cell proportions
Transcription factor module analysis（pySCENIC）
Fate decision tree construction (regulon-based)(scanpy)
Trajectory analysis(PAGA)
Cell-cell interaction and network representation analysis
生活很好，有你更好
