一、hisat2进行转录组比对
1. 首先下载参考基因组
在NCBI,UCSC和Ensemble数据库都可以下载到参考基因组，这里下载UCSC的参考基因组。
https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/
1.png
wget https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/chromFa.tar.gz
tar -zxvf chromFa.tar.gz
cat *.fa > hg19.fa
rm chr*.fa #删除合并前的文件
2. 参考基因组注释下载
wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_40/gencode.v40.annotation.gtf.gz
gunzip gencode.v40.annotation.gtf.gz
2.png
3. 建立索引
将外显子加入索引
hisat2_extract_exons.py gencode.v40.annotation.gtf > exons.txt
将剪切位点加入索引
hisat2_extract_splice_sites.py gencode.v40.annotation.gtf > ss.txt
建立索引
hisat2-build -p 4 --ss ss.txt --exon exons.txt hg19.fa hg19
注意：建立索引需要有较高的电脑配置或需要服务器，普通电脑一般去hisat2官网下载即可
下载地址： http://daehwankimlab.github.io/hisat2/download/#h-sapiens
3.png
4. 比对
hisat2 -p 4 -x /mnt/e/reference/hg19/genome -1 /mnt/d/bioinfo/project/rna/02clean/SRR15859344_1.clean.fastq.gz -2 /mnt/d/bioinfo/project/rna/02clean/SRR15859344_2.clean.fastq.gz -S /mnt/d/bioinfo/project/rna/03alin/SRR15859344.sam
p: 线程数
x: 索引位置
-1 -2: 双端测序的两端数据
-S: 输出文件路径
将sam文件转为bam文件（samtools软件）
单个文件处理
samtools sort -O bam -@ 5 -o SRR15859344.bam SRR15859344.sam
多个文件批量处理
ls *.sam |while read id; do (samtools sort -O bam -@ 5 -o $(basename ${id} ".sam").bam ${id});done
#".sam"表示去掉文件名后面的.sam；
#basename $id ".sam".bam为去掉.sam加上.bam，也就是把文件名后缀改为.bam；
为bam文件构建索引
为bam文件构建索引
目的
必须对bam文件进行默认情况下的排序后，才能进行index。否则会报错。建立索引后将产生后缀为.bai的文件，用于快速的随机处理。很多情况下需要有bai文件的存在，特别是显示序列比对情况下。比如samtool的tview命令就需要；gbrowse2显示reads的比对图形的时候也需要。IGV显示比对情况也需要。
单个文件处理
samtools index -@ 4 SRR15859344.bam
多个文件批量处理
ls *.bam |xargs -i samtools index {}
二、counts表达矩阵
对bam文件进行定量（featureCounts）
featureCounts -a /mnt/e/reference/gencode.v40.annotation.gtf -F gtf -t exon -g gene_id -p -T 4 -o /mnt/d/bioinfo/project/rna/04count/expr_matrix.txt /mnt/d/bioinfo/project/rna/03alin/SRR15859344.bam
#bam/*.bam为bam文件地址
#expr_matrix.txt文件就是下游分析的表达钜阵文件
经过上面的步骤我们就可以拿到RNA-seq的表达矩阵了，后面就可以进行下游的R语言分析，如差异基因分析，GO和KEGG分析等。
RNA-seq入门
RNA-seq入门（三）比对、输出表达矩阵
