Combined Alcohol Exposure and KRAS Mutation in Human Pancreatic Ductal Epithelial Cells Induces Proliferation and Alters Subtype Signatures Determined by Multi-Omics Analysis
人类胰腺导管上皮细胞的酒精暴露和KRAS突变共同诱导增殖并改变由多组学分析确定的亚型特征
发表期刊：Cancers (Basel)
发表日期：2022 Apr 13
DOI: 10.3390/cancers14081968
一、背景
胰腺导管腺癌目前是美国癌症相关死亡的第四大原因，患者的5年生存率只有10%，部分原因是其高转移率和治疗抗性。改善PDAC患者的生存状况需要详细了解影响疾病进展和治疗反应的基本分子特征。有研究发现，PDAC的4种不同亚型（代谢性，祖细胞样，增殖性和炎症性）可以为精准治疗提供途径，因为亚型可以预测治疗反应。然而，影响不同PDAC亚型发展的遗传和环境因素需要额外的评估。
PDAC中四个最常突变的基因是KRAS，TP53，CDKN2A和SMAD4。超过90%的PDAC有KRAS的激活突变。KRAS是PDAC中最常观察到的突变，但在其他癌症类型中经常观察到其他RAS / RAF / MAPK途径成员的失调和突变。野生型KRAS PDAC肿瘤通常通过BRAF突变显示MAPK途径的激活，这表明KRAS和BRAF突变可以在MAPK途径的激活中相互补偿。因此，PDAC高度依赖于MAPK途径的激活来驱动增殖并启动癌变。
有几个潜在的原因和危险因素与PDAC的发展有关，包括PDAC的家族史、慢性胰腺炎、吸烟、糖尿病、肥胖和饮酒，但它们与该疾病的某些亚型的发展的关系还不明确。最近的证据表明，在KRAS突变的情况下，酒精摄入会促进PDAC的发展，这表明内在和外在的因素共同影响PDAC发展。
二、材料与方法
1、数据来源
1） 细胞：HPNE（人胰腺巢蛋白表达）细胞；HPNE-KRAS细胞含有一个组成活性的KRAS G12D突变
2） 通过 cBioportal 访问来自 TGCA Firehose Legacy 的 PDAC 患者的 SERPINE1 蛋白表达数据
2、分析流程
1）细胞培养、 增殖试验、Caspase-3 凋亡试验、细胞周期分析、乙醛检测、细胞ROS的测量、细胞ROS的测量
2） 蛋白质实验：肽的制备、TMT标记、LC/MS-MS和蛋白质鉴定
3） 差异表达：在DESeq2归一化之后，RNA-Seq转录本按生物类型（Ensembl）进行分类；R被用来生成RNA序列和蛋白质组学数据集的分层聚类热图
4） GO术语分析：RNA Seq和蛋白质组学数据的GO术语分析是通过DAVID生物信息学使用过滤的GO FAT本体术语（不包括背景集）完成的
5） 多重共惯性分析：多重共惯性分析在R语言中使用omicade4软件包完成
6） 差异性共表达：为了研究哪些蛋白质在HPNE中协调表达，以及乙醇和突变的KRAS如何改变协调表达的蛋白质，进行了差异性共表达分析
7） 定量反转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、蛋白质印迹、化疗药物治疗和活力测定
三、实验结果
01 - 慢性乙醇处理促进了KRAS突变HPNE细胞的增殖
本研究使用了未转化的人胰腺巢蛋白表达（HPNE）和突变的KRAS G12D转化的HPNE（HPNE-KRAS）细胞，以评估酒精在与胰腺癌最常见早期突变事件有关的特定细胞和遗传背景下的影响。由于个体之间行为的可变性，人类的酒精使用很难建模。酒精暴露发生在数年和十年内，并可能通过慢性和/或急性暴露影响分子、细胞或组织。为了在6个月的短时期内建立酒精暴露的模型，作者用100mM EtOH每2-3天处理一次HPNE和HPNE-KRAS细胞。这使作者能够检查乙醇暴露对野生型KRAS和组成型活性KRAS（G12D）表达的胰腺细胞的影响。乙醇处理6个月后，评估了细胞增殖的表型变化，并进行了蛋白质组和转录组的多组学分析（图1A）。
HPNE和HPNE-KRAS细胞都能耐受乙醇暴露，在治疗期间没有观察到明显的细胞死亡。在开始乙醇处理6个月后，HPNE细胞在对照和乙醇处理条件下的增殖没有表现出任何差异（图1B）。然而，与对照组细胞相比，用乙醇处理的HPNE-KRAS细胞显示出其增殖率的明显增加（图1C）。对这些细胞在培养中的倍增时间的分析证实，与对照组相比，EtOH处理促进了HPNE-KRAS的快速生长（图1D）。与未经处理的HPNE-KRAS对照组细胞相比，EtOH处理的HPNE-KRAS细胞的增殖与处于G1期的细胞百分比的增加有关，而处于G2期和S期的细胞数量较少。而在用EtOH理的HPNE细胞中，与未处理的HPNE细胞相比，G1期的细胞减少，G2和S期的细胞增加（图1E）。
在乙醇条件的HPNE-KRAS细胞培养物中观察到的迅速扩大的细胞群也可能是受细胞死亡率变化的影响。慢性乙醇处理已被证明能诱导各种非转化细胞类型，包括β细胞和T细胞的Caspase-3激活和凋亡。对照组和EtOH处理的HPNE细胞之间的caspase-3活性没有差异。然而，EtOH处理的HPNE-KRAS细胞在稳态培养中显示出caspase-3活性的下降（图1F）。这些结果共同表明，细胞周期的变化和凋亡率的降低导致EtOH处理的HPNE-KRAS细胞的群体倍增时间缩短。
02 - 突变体KRAS和乙醇处理会增加核糖体和RNA代谢基因的表达
对HPNE细胞系进行RNA-Seq分析，以鉴定受KRAS突变和EtOH暴露影响的基因表达特征，确定了6个表达相似的基因簇（图2A）。与野生型HPNE细胞相比，在HPNE-KRAS突变体细胞的背景下，观察到由于EtOH调节导致基因的表达倍数变化差异更大（图2B）。与HPNE细胞（3105个转录本）相比，HPNE-KRAS细胞还表现出与EtOH处理有关的更多不同表达的转录本。仅在蛋白质编码基因中，有997个基因的倍数变化为2或更大，而728个基因的倍数变化为-2或更低。在HPNE EtOH和HPNE-KRAS EtOH细胞中，有184个普遍上调的基因和179个普遍下调的基因（图2C），表明EtOH调节对这些基因的调控有保守的影响，与KRAS突变状态无关。然而，1635个上调和1388个下调的基因与HPNE-KRAS细胞的EtOH处理有独特的联系，而HPNE细胞的EtOH调理则有303个上调和280个下调的基因（图2C）。这些结果共同表明，胰腺细胞中潜在的KRAS突变可能加剧长期乙醇暴露引起的基因表达失调。
为了评估这些不同表达的蛋白编码基因的共同特征，使用DAVID对HPNE（图2D,E）和HPNE-KRAS（图2F,G）细胞系进行了GO富集分析。与HPNE细胞中EtOH调节相关的上调基因集富集对应于细胞外区域和质膜组分的细胞组分（CC），同时鉴定出用于受体结合，钙离子结合和生长因子活性的富集分子功能（MF）（图2D）。在HPNE细胞中与EtOH调节相关的下调基因中，富集GO项是BP类别中的细胞表面受体信号传导，细胞或亚细胞组分的运动以及CC类别中的质膜成分（图2E），类似于在上调基因集中观察到的结果。在EtOH条件的HPNE-KRAS细胞中，上调基因在BP类别中靶向质膜和ER项的蛋白质中富集，CC类别中的核糖体组分项以及MF类别中的rRNA代谢/处理项（图2F）。在HPNE-KRAS乙醇处理细胞中下调的基因在细胞外基质和结构组织以及细胞 - 细胞信号传导（BP）中富集;质膜和细胞外基质成分，神经元和突触部分（CC）;钙离子结合，受体结合和活性以及糖胺聚糖结合（MF）（图2G）。KRAS突变和EtOH处理对核糖体基因表达的综合影响表明，蛋白质表达谱可能受到影响。
03 - 突变的KRAS和乙醇处理增加了核糖体和RNA处理蛋白
为了描述EtOH和KRAS突变对HPNE细胞的蛋白质水平的影响，作者使用了定量蛋白质组学，每个条件有3个生物重复。检测了3861个蛋白质。将每种条件下至少具有3个重复值中的2个的蛋白质纳入进一步分析。在HPNE和HPNE-KRAS细胞中，共有3167和3210个蛋白质分别符合这些要求（图3A）。使用主成分分析（PCA）来可视化每个样品蛋白质组的变化和模式（图3B）。与未经处理的HPNE细胞相比，EtOH处理对蛋白质组的变化影响相对较小。然而，与未经处理的HPNE-KRAS对照细胞相比，突变KRAS表达背景下EtOH处理对蛋白质组的变化有较大影响（图3B）。与RNA-seq的结果一样，与HPNE相比，EtOH处理对HPNE-KRAS细胞的蛋白质表达差异有较大的影响。在±1.25的倍变阈值和FDR≤0.05来定义差异表达的蛋白质时，与未处理的HPNE-KRAS细胞相比，132种蛋白质（95种上调和37种下调）在HPNE-KRAS EtOH中差异表达（图3C）;然而，在HPNE细胞中没有蛋白质达到这个FDR阈值。
通过DAVID进行GO术语富集分析，以确定与HPNE和HPNE-KRAS细胞系中不同表达的蛋白质相关的重要术语（图3D-G）。富含HPNE EtOH上调蛋白的生物过程（BP）项主要与RNA处理和剪接有关，细胞组分（CC）项包括核糖核蛋白和剪接体复合物，分子功能项（MF）包括参与细胞 - 细胞粘附的钙粘蛋白结合，以及poly（A）和RNA结合（图3D)。在用EtOH处理的HPNE细胞中，下调蛋白的首要条件是生物体（BP）细胞外细胞器（CC），氧化还原酶和苏氨酸型内肽酶活性（MF）之间的细胞间相互作用（图3E）。Poly（A）和RNA结合也是与下调蛋白和上调蛋白相关的重要术语。与RNA Seq数据一样，观察到在HPNE-KRAS EtOH上调和下调的蛋白质中，所有三个GO类别都有更多的富集术语（图3F,G）。上调的蛋白质富集于蛋白质靶向ER和核糖体；与翻译、rRNA/RNA处理和结合有关的功能经常出现在GO术语结果中（图3F）。下调的基因富集在细胞外结构组织、质膜成分和钙离子结合方面（图3G）。
04 - 慢性乙醇调理后，乙醇代谢受到轻微的影响
在高浓度乙醇的条件下，乙醇可以被CYP2E1（细胞色素P450 2E1）代谢，它产生的ROS是反应的副产品，有可能对DNA和蛋白质造成损害，从而促进癌症的发展（图4A）。因此，作者测量了用EtOH调理的HPNE和HPNE-KRAS的基线乙醛和ROS水平，与类似的未处理的对照细胞相比，以及它们对急性EtOH刺激（测量前100mM培养1小时）的反应。虽然急性EtOH刺激增加了乙醛的产生，但在不同的细胞系之间没有观察到乙醛浓度的明显差异，不管EtOH调节状态如何（图4B）。同样，除了非乙醇处理的HPNE-KRAS细胞在急性乙醇刺激后表现出ROS水平的增加外，不同的细胞系之间的ROS水平也没有急剧变化（图4C）。乙醛和ROS的产生缺乏明显的变化，这也反映在蛋白质组数据中。在蛋白质组学实验中检测到的与乙醛代谢有关的大多数酶在HPNE和HPNE-KRAS细胞中的表达水平相似，并且不受乙醛调节的影响（图4D）。例外的是AKR1A1和ALDH1B1，它们分别在EtOH条件的HPNE-KRAS细胞中下调或上调（图4D）。ALDH1B1和突变KRAS被认为与驱动PDAC的开始有关。总之，这些结果表明，在HPNE-KRAS细胞中，与EtOH调节有关的表型变化可能不是由于与EtOH代谢途径有关的适应性。
05 - 用乙醇处理的突变体KRAS细胞显示出RNA和蛋白质表达之间的相关性增加
进行多重共性分析（MCIA）来观察每个样品的RNA-Seq和蛋白质组学数据之间的关系。在HPNE、HPNE EtOH和HPNE-KRAS条件下，RNA-Seq和蛋白质组学数据有所不同，如类似条件下数据类型点的分离度增加所描绘的（图5A）。有趣的是，HPNE-KRAS EtOH RNA-Seq和蛋白质组学数据表现出高度的相似性，表明这些细胞的转录和翻译过程之间的相关性增加。
使用HPNE-KRAS EtOH数据集，作者在RNA-Seq和蛋白质组学数据集中鉴定出44种转录本和蛋白质，这些转录本和蛋白质一致地上调（n = 33）或下调（n = 11）（图5B，C）。选择在增殖过程中具有已知功能的基因/蛋白，包括PRP19、CD81、ZPR1、RUVB1、RHOG和NT5E，通过q-RT-PCR和Western blot分析来验证RNA-Seq和蛋白组学数据（图5D-I）。CD81（图5D），RHOG（图5E），ZPR1（图5F），RUVBL1（图5G）和PRPF19（图5H）的蛋白质和mRNA水平在HPNE-KRAS细胞中响应EtOH调节而增加，而NT5E（图5I）mRNA降低，这些细胞中的蛋白质水平仅略微降低。这些结果与蛋白质组学和RNA-Seq数据基本一致（图5C由基因/蛋白质名称前面的星号表示）。
06 - SERPINE1是EtOH调理的HPNE-KRAS细胞中特有的高度相关的蛋白质
为了确定蛋白质之间潜在的重要调节关系，作者进行了差异化的共表达分析，重点关注EtOH条件下的HPNE-KRAS。确定了哪些蛋白质被共同表达，以及在突变体KRAS表达和EtOH处理的情况下共同表达如何变化。总共确定了287种具有561个正或负相关的蛋白质（图6A）。在许多情况下，在HPNE-KRAS EtOH细胞中发现了具有正相关的蛋白质-蛋白质对，但在HPNE、HPNE EtOH和HPNE-KRAS细胞中发现这些相同的蛋白质对是负相关的或不相关的。同样，在HPNE-KRAS EtOH细胞中表现出负相关的蛋白质-蛋白质对，在HPNE、HPNE EtOH和HPNE-KRAS细胞中可以发现正相关或不相关。
有几个高度相关的蛋白质在组合网络中被确定为负相关和正相关，包括纤溶酶原激活物抑制剂1（PAI1，又名SERPINE1）（图6B,C）。SERPINE1是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，被大多数人类癌细胞系过度表达，被认为通过细胞周期进展刺激生长，并通过激活蛋白酶活化受体（PAR）间接刺激生长。根据Fisher's Exact Score，确定了与SERPINE1有正相关或负相关的蛋白质的前五个GO/KEGG通路术语（图6C）。与 SERPINE1 正相关网络蛋白相关的最重要的术语之一是“酗酒”。SERPINE1负相关网络的另一个重要术语是 "丙酮酸代谢过程"（图6C）。乙醇分解和丙酮酸盐均产生乙酰辅酶A，丙酮酸随乙醇暴露而降低。SERPINE1的差异共表达网络表明该蛋白可以作为调节胰腺细胞对乙醇暴露反应的 "枢纽 "蛋白。事实上，来自PDAC患者的TCGA数据对酒精摄入频率的注释表明，SERPINE1蛋白的表达与酒精使用频率的增加呈负相关（图6D）。同样，蛋白质组学数据显示，与未经处理的HPNE-KRAS EtOH细胞相比，SERPINE1的表达明显下降（图6E）。此外，SERPINE1的低表达与PDAC患者的明显生存优势有关（图6F）。总之，这些结果表明，SERPINE1是HPNE-KRAS细胞中受酒精暴露调节的蛋白质网络中的一个高度互连的节点，这可能对患者的生存有影响。
07 -乙醇处理改变了 PDAC 亚型
先前在转移性PDAC组织中的蛋白质组学观察表明，这些患者的酒精使用与炎症亚型的减少以及增殖性和代谢亚型的增加有关。为了确定在HPNE细胞系中存在或不存在突变的KRAS时，EtOH对亚型特征的影响，作者评估了具有或不具有EtOH调节的每种HPNE和HPNE-KRAS细胞系的PDAC亚型特征（图7A-D）。EtOH对HPNE细胞的亚型特征没有明显影响。然而，HPNE-KRAS EtOH细胞的增殖性（图7A）和代谢性（图7C）亚型特征明显增加，炎症性亚型特征明显减少（图7B）。值得注意的是，在HPNE-KRAS细胞中，对EtOH调理反应的亚型特征的变化最明显的是炎症性特征的抑制和代谢性特征的增加（图7B，C）。表明EtOH对PDAC亚型发展的影响可能取决于KRAS的突变状态。
此外，以前的研究确定，对FOLFIRINOX疗法的临床反应也与PDAC亚型有关。由于对EtOH调理的亚型特征的转变也可能影响对治疗药物的反应，作者分析了三种常用的胰腺癌药物（吉西他滨、伊立替康和奥沙利铂）对细胞活力的影响（图7E-G）。与对照组HPNE细胞相比，EtOH处理HPNE细胞导致吉西他滨处理的EC50较低，但在该细胞系中没有观察到伊立替康或奥沙利铂处理对EC50的影响。然而，与对照组HPNE-KRAS细胞相比，吉西他滨（图7E）、伊立替康（图7F）和奥沙利铂（图7G）的EC50s在HPNE-KRAS EtOH细胞中明显降低。这些结果与预期一致，即随着细胞获得代谢特征并失去炎症特征，治疗反应将得到改善。
四、结论
这项研究确定，酒精优先诱导和增加表达突变KRAS的胰腺HPNE细胞的增殖潜力。研究表明，酒精对胰腺细胞的影响取决于细胞的KRAS突变状态。结合起来，酒精和突变的KRAS会增强增殖表型，并影响与转录组和蛋白质组的改变相关的亚型划分。
