说在前面

今天为大家分享一篇Cell Reports（IF 9.995）上的肿瘤中代谢相关文章“Metabolism drives macrophage heterogeneity in the tumor microenvironment”。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境（TME）中的主要的免疫细胞类型。然而，TAMs的表型和肿瘤微环境代谢模式之间的关系仍不清楚。围绕这个科学问题，作者对结直肠癌肝转移小鼠的肝脏机型单细胞转录组分析，发现TAMs在转录、发育、代谢和功能水平上表现出高度的异质性。

研究背景

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肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是肿瘤微环境（TME）中的主要细胞类型。TAMs与肿瘤病理生物学的多个方面相关，如免疫抑制、新生血管形成、转移和治疗耐药性。在适当的刺激下，巨噬细胞被激活成不同的炎症状态，包括M1（经典激活）和M2（选择性激活）两类。M1巨噬细胞具有促炎作用，与细菌及细胞内病原体的免疫反应相关。相反，M2具有抗炎作用，在血管生成和伤口愈合中发挥功能。M2也与辅助性T细胞2（Th2）反应相关。因此，巨噬细胞可能直接介导肿瘤杀死某些类型的癌症，并与改善患者预后相关。TAMs的表型和代谢模式之间的关系仍不清楚。目前，已有一些研究从单细胞转录组层面分析了细胞内信号反应、细胞类型特异性途径、潜在功能和主要代谢途径的活性等信息，并发现代谢可以重塑肿瘤微环境中细胞状态，并改变随肿瘤微环境的变化TAMs的表型和功能改变。于是作者通过对携带肝转移性肿瘤的小鼠的肝脏TAMs进行了单细胞转录组分析，TAMs具有发育、代谢和功能异质性，嘌呤代谢可能是前肿瘤巨噬细胞群体的一个关键代谢特征。

研究内容

1. 单细胞转录组测序揭示了TAMs的代谢异质性

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为了鉴定肝脏TME中的巨噬细胞，从有MC38皮下肿瘤和没有MC38肿瘤的小鼠肝脏中分离了肝单核细胞进行scRNAseq。合并正常和肿瘤样本后，CCA去批次后进行聚类和细胞注释，展示了UMAP分析（图1A和1B）聚类后，作者鉴定了14个转录不同的巨噬细胞亚群。并将整合的数据集分成2个投影，其中2021个来自非肝肿瘤小鼠的肝巨噬细胞（正常巨噬细胞）和6035个来自非肝肿瘤小鼠（TAMs）的肝巨噬细胞（图1C）。并对正常和肿瘤中不同cluster的细胞进行细胞数量统计（图11D）。与正常样本相比，肿瘤样本中簇0、1、4、5、5、6、9、12和13的相对大小增加，簇2、3、7、10、11的大小减小。这些数据揭示了肝内TAM的高度异质性，并表明肿瘤对TAM组成有重要影响。

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肝巨噬细胞表现出不同的起源、位置和时间。为了阐明这些肝巨噬细胞在转移小鼠和原发小鼠中的潜在发育来源，通过marker基因对14个细胞粗进行细胞注释分析，鉴定了4种类型的巨噬细胞，包括肝脏驻留的巨噬细胞（Kupffer细胞）单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）、肝囊巨噬细胞（LCMs）和腹膜巨噬细胞（PMs）（图2E-2G）对每个聚类中的可变基因进行主成分分析（PCA），每个细胞类型聚类具有相似的细胞特性（图2H）。为了研究巨噬细胞的发育特征，作者从几个常规的代谢功能进行研究。研究发现，肝脏驻留的巨噬细胞显示出铁代谢活性，大多数MDM簇表现出较高的缺氧和增殖活性。除Kupffer细胞外，mdm、LCMs和PMs均表现出免疫抑制潜能，如免疫抑制基因Tgfb1、Vsir、Pirb和Trem2在TAMs中高表达（图2I）。总之，通过单细胞转录组鉴定了来自4个可能的不同发育来源的14个肝巨噬细胞簇，揭示了肝脏TME中巨噬细胞的高度异质性。

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代谢影响免疫细胞的表型和功能，包括免疫细胞的肿瘤微环境。为了能够更精准的研究肝脏肿瘤微环境中巨噬细胞亚群的代谢特征，对KEGG中的60个代谢途径进行了GSEA（图3A）。结果发现，14个巨噬细胞簇显示出不同的代谢活性（图3B和3C），肝脏微环境中的TAMs表现出不同的代谢活动。于是在单细胞水平上探索肝巨噬细胞的代谢异质性。通过1310个代谢基因进行GO分析，发现与GSEA结果一致，8056个巨噬细胞表现出异质性的代谢模式。

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基于PCA和Pearson相关矩阵的相似性分析，将肝巨噬细胞分为5个代谢簇，具有脂质代谢、嘌呤代谢、氨基酸（AA）代谢、OXPHOS和糖酵解等特征（图4E）。对每个代谢聚类中代谢基因特征的GSEA进行进一步的GO分析，发现每个代谢类型在相应的代谢聚类中主要富集（图4F）。代谢聚类可能会区分出不同来源的巨噬细胞（图4G-I）。但将TAMs分类为M1型和M2型存在一定的局限性，于是通过代谢谱对TAMs进行分类可以为TAM的异质性提供更准确的依据。营养物质和代谢物可以通过其溶质载体（SLCs）运输，是代谢活动的先决条件。根据分析结果，作者发现TAM亚群的不同代谢活动，葡萄糖转运体SLC2A1在糖酵解簇中高表达，而鸟氨酸转位酶SLC25A15在AA簇中高表达（图4J）。此外，预测有不同的转录因子调控每个代谢簇中前10个高表达基因的表达（图4K）。为了识别正常巨噬细胞和TAMs之间的代谢差异，作者将整合的和代谢标记的巨噬细胞投影仪分为两个投影仪（图4L）。肿瘤细胞的存在显著地改变了肝巨噬细胞的代谢谱（图4L-M）。免疫荧光染色显示，与肝脏中的TAMs相比，Kupffer细胞主要位于瘤周区域（图4N），提示该细胞的定位可能形成其代谢谱。值得关注的是，所有肿瘤诱导的代谢簇主要来自MDMs，并贡献了67.7%的TAMs（图4M和4O）。这些结果表明TAMs被代谢重编程，其中MDMs在肝脏TME中被严重的代谢重编程。

2. TAM的代谢模式与其功能特征相关

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代谢谱与TAMs的表型和功能相结合。在巨噬细胞中的5个代谢簇（图4E）中发现了差异表达的基因（DEGs）。为了进一步研究TAM的代谢谱是否与肿瘤中的功能相关，不同代谢簇中的吞噬作用、抗原呈递、血管生成、免疫抑制和M1/M2样极化（图5A-5I）。糖酵解的TAMs具有最高的吞噬能力（图5A-5C）。与具有其他代谢谱的TAMs相比，具有嘌呤代谢的TAMs的抗原呈递能力最低（图5D-5F）。此外，具有肿瘤诱导代谢特征的TAMs，包括嘌呤代谢、AA代谢和糖酵解（图4L），表达了高水平的促血管生成基因（图5G-5I）。结果发现无论样本来源如何，处于相同代谢状态的巨噬细胞倾向于显示出与PCA相似的功能基因模式（图5J）。这些数据表明，不同的代谢模式与TAMs中不同的功能程序相关。

3. 嘌呤代谢TAMs终末分化且介导免疫抑制

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基于TAMs中代谢模式和功能程序之间的关系，作者研究了TAMs的代谢重构是否与其细胞分化相关。通过scVelo进行的RNA速度分析，研究代谢重编程后细胞分化。由此发现，巨噬细胞群体中的代谢转录程序发生了显著的动态变化（图6A和6B）。RNA速度分析显示，5个代谢群体的细胞状态不同（图6C）；其中，嘌呤代谢巨噬细胞处于终末期（图6C-6F）。由于嘌呤代谢巨噬细胞位于运动轨迹的晚期，占所有TAMs的43.8%，作者重点分析了嘌呤代谢巨噬细胞。

研究发现，嘌呤代谢的TAMs可能是终末分化的，介导免疫抑制，并具有血管生成的效力为了支持这一观点，嘌呤代谢基因特征与血管生成特征呈强正相关，与抗原呈递基因特征呈负相关（图6H）。相反，其他代谢特征与血管生成或抗原呈递基因特征都没有显示出很强的相关性。此外，伪时间分析表明，巨噬细胞在从脂质代谢转向嘌呤代谢时，在获得血管生成相关基因的表达时，逐渐失去了抗原呈递相关基因的表达。此外，嘌呤代谢巨噬细胞表达了三种潜在的免疫抑制分子随着伪时间的推移逐渐获得（图6I），并与嘌呤代谢特征的表达相关（图6J-6K），而与其他三个代谢特征的表达不相关（图6K）。这些数据表明，嘌呤代谢的TAMs可能是终末分化的，介导免疫抑制，并具有血管生成的效力。为了实验验证观察结果，对肝巨噬细胞进行了分类，并检测了关键嘌呤通路基因的蛋白表达，包括嘌呤核苷磷酸化酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶。与它们的转录水平一致（图6G），与没有肿瘤的肝脏巨噬细胞相比，TAMs中PNP和APRT的蛋白水平更高（图7A）。使用TREM2作为表面标记物，发现TREM2+巨噬细胞表现出更高的PNP活性，并表达了更高水平的AMP和腺苷，这是APRT下游的两个关键代谢物（图7B-7E）。此外，与无肿瘤的肝脏相比，有肿瘤的肝脏中有更多的TREM2+巨噬细胞（图7F-7H）。TREM2+巨噬细胞中MHC-II（I-A/I-E）和MHC-I（H-2Db）的表达较低（图7I和7J），表明其抗原呈递能力降低。这些数据与我们的转录本分析结果一致（图6G和6H）。这些结果表明嘌呤代谢TAMs在TME中具有最终分化和免疫抑制作用。

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4. 嘌呤代谢性TAMs与临床结果相关

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通过对3个接受ICB治疗的患者队列进行研究，作者发现无应答者的TAMs中嘌呤代谢基因的表达水平始终高于有应答者（图8A），并且与基线样本相比，来自无反应者的TAMs在处理后的样本中显示出嘌呤代谢基因的表达更高（图8B和8C）。因此，TAMs中的嘌呤代谢可能有助于原发性和获得性治疗耐药性。接下来，研究了TAMs中嘌呤代谢基因的表达水平与患者生存率之间的关系。与低危组相比，嘌呤代谢基因如APRT、NT5C2、PAICS在高危组中表达量较高（图7G，下），大多数患者死亡（图7G，中），总生存期较短（图7H）。Cox比例风险模型（Cox-PH）分析显示，与嘌呤代谢基因中嘌呤代谢基因表达较低的患者相比，TAMs中嘌呤代谢基因表达较低的患者预后较差（图7I）。结果表明，嘌呤代谢基因的表达水平与ICB反应相关，并与患者的预后相关。

说在最后

综合分析和验证实验表明，嘌呤代谢增加是肿瘤肿瘤前和终末分化表型的一个特征。与小鼠TAMs一样，人类TAMs也是高度异质性的。嘌呤代谢增加的人类TAMs表现出前肿瘤表型，并与免疫检查点封锁的治疗效果较差相关。总之，TAMs具有发育、代谢和功能异质性，嘌呤代谢可能是前肿瘤巨噬细胞群体的一个关键代谢特征。这篇文章分析的一个局限性是其相对依赖于转录组谱，而代谢蛋白表达水平、代谢酶活性、环境调节机制，可能协调决定肿瘤免疫中特定代谢途径。所以，未来可以通过高通量代谢蛋白质组学分析，以及功能研究，来充分表征TAMs。

[参考文献]

Li, S., Yu, J., Huber, A., Kryczek, I., Wang, Z., Jiang, L., . . . Zou, W. (2022). Metabolism drives macrophage heterogeneity in the tumor microenvironment. Cell Rep, 39(1), 110609. doi:10.1016/j.celrep.2022.110609