SgRNA设计
目的基因SgRNA如何设计以及载体构建
简单目的SgRNA设计
目前SgRNA设计网站较多，张锋实验室总结了一下SgRNA设计工具https://zlab.bio/guide-design-resources，以BROAD实验室的GPP Web Portal 设计工具为例
首先进入其网址
操作非常简单，页面上方是三种不同的目的SgRNA设计：CRISPRKO,CRISPRa,CRISPRi
首先选择是敲除，激活还是抑制的SgRNA设计
在
CRISPR Enzyme处选择CAS蛋白类型，一般默认SpCas9然后选择靶向的物种
在
Specify Target下面的方框中输入你SgRNA靶向的基因ID或者序列人机验证
Submit提交即可
注：可查看官方帮助文档进一步了解该工具的使用
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然后进入结果界面
下载结果即可查看设计完成的SgRNA以及靶向评分
结果展示为txt文件，可以在excel中导入数据方便查看：
sgRNA的序列与On-target和Off-target的匹配数都应尽可能的高，一般大于60，认为是可用的。一般选择前面几个的排序最优的SgRNA，可以考虑多合成几个进行实验验证。
注意
具体设计SgRNA来说需要根据实验要求，针对性的敲除单一转录本或者尽可能的影响所有转录本的转录，这需要自己去找到靶基因及其所有转录本综合分析。
载体构建-敲除
lentiviral CRISPR/Cas9 and single guide RNA
参：https://www.addgene.org/52961/
载体简介
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lentiCRISPRv2 (one vector system):
这个质粒包含两个重要的元件：hspCas9和嵌合的前导RNA。前导RNA即SgRNA是与靶向序列位点(20bp)互补配对的，而且靶向位点序列的3'端必须紧邻PAM基序（NGG）。载体经过BsmBⅠ限制性核酸内切酶消化后，设计好的SgRNA经退火后形成的一对寡核苷酸片段就可以连接到载体的SgRNA scaffold上。
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lentiGuide-Puro (two vector system):
这个质粒只有SgRNA，没有Cas9元件，必须配合 lentiCas9-Blast (a separate lentiviral construct that delivers hSpCas9 and blasticidin resistance) 使用。该质粒使用方法就是预先在你的靶细胞系中转染lentiCas9-Blast，通过单克隆培养，使你的细胞系表达Cas9蛋白，然后再转染lentiGuide-Puro，整合进SgRNA。该载体连接寡核苷酸片段的酶切位点也是BsmBⅠ。
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选择载体——Which vector to use
lentiCRISPRv2由第一代lentiCRISPRv1升级而来，其产毒效率（病毒滴度）是第一代的约10倍。lentilGuide-Puro 的产毒效率则更高，大约是lentiCRISPRv1的100倍，但是转染lentilGuide-Puro 的细胞系需要预先整合Cas9基因（使用 the separate lentiCas9-Blast 慢病毒转染）。对于不能提前整合表达Cas9的（比如原代细胞系），则建议使用lentiCRISPRv2。转染后，lentiCRISPRv2 或者 lentiGuide-Puro稳转株筛选条件为嘌呤霉素。
产毒——Lentiviral production
在开始任何慢病毒工作之前，请确保操作环境符合政府/机构/大学的卫生和安全规范。
慢病毒包装体系
transfer plasmid (e.g.lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro)
packaging plasmids pVSVg (AddGene 8454) and psPAX2 (AddGene 12260)
包毒：
将transfer plasmid和packaging plasmids共转进 HEK293(F)T 细胞
阳性对照：
CMV-EGFP lentiviral transfer plasmid (eg. AddGene 19319).
SgRNA合成
为了将目标序列克隆到lentiCRISPRv2或lentiGuide-Puro主链中，合成以下形式的两个oligos
连接载体和寡核苷酸片段采用酶切连接的方式。lentiCRISPRv2, lentiGuide-Puro or lentiCRISPRv1这三种质粒都可以用BsmBⅠ限制性核酸内切酶酶切，形成的末端都是相同的粘性末端，即合成oligos的时候5‘和3’末端添加的同源序列是一样的。
注意：
如果构建U6启动子或T7启动子驱动sgRNA的表达载体，需要考虑sgRNA的5'碱基为G或GG，来提高其转录效率。
举例说明：
以lentiCRISPRv2载体为例，说明sgRNA是如果构建到该载体中。首先，将设计好的sgRNA中的U碱基改成T碱基，如TP53基因的sgRNA序列为5’-CAUUGCUUGGGACGGCAAGG-3’，修改后的碱基为5’-CATTGCTTGGGACGGCAAGG-3’，该序列的反向互补序列为3’-GTAACGAACCCTGCCGTTCC-5’。正向序列和反向互补序列退火成双链后就可以连接到载体中，但是需要在序列两端添加BsmBI酶切后的同源序列，如下图所示：
合成这两条互补的序列后，退火成双链就可以连接到用BsmBI酶切后的LentiCRISPRv2载体中。
载体构建
- LentiCRISPR载体酶切和去磷酸化，用BsmBI在37℃酶切30min
| 5 ug | lentiCRISPRv2 or lentiGuide-Puro |
|---|---|
| 3 ul | FastDigest BsmBI (Fermentas) |
| 3 ul | FastAP (Fermentas) |
| 6 ul | 10X FastDigest Buffer |
| 0.6 ul | 100 mM DTT (freshly prepared) |
| X ul | ddH2O |
| 60 ul | total |
- 琼脂糖凝胶纯化酶切的LentiCRISPRv2载体
LentiCRISPR载体的大小为14,873bp，酶切后产生两个片段，一条大的为目的片段，小片段大小为1885bp。在LentiCRISPRv2载体中有两个BsmBI酶切位点，两个位点之间的片段为1885bp，酶切连接后sgRNA正好在U6启动子下游，连接后的sgRNA下游就是gRNA scaffold序列，与sgRNA一起转录出来发挥gRNA的引导功能。
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Oligo磷酸化和退火成双链DNA
1 ul Oligo 1 (100 μM) 1 ul Oligo 2 (100 μM) 1 ul 10X T4 Ligation Buffer (NEB) 6.5 ul ddH2O 0.5 ul T4 PNK (NEB M0201S) 10 ul total buffer使用的是T4连接buffer，里面含有ATP；如果使用T4 PNK对应的buffer，则需要添加1mM的ATP
反应体系：
37℃ 30 min 95℃ 5 min and then ramp down to 25℃ at 5℃/min
将步骤3中退火过的寡核苷酸以1:200稀释到无菌水或EB中。
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连接反应：室温孵育10 min
X ul BsmBI digested plasmid from Step 2 (50ng) 1 ul diluted oligo duplex from Step 4 5 ul 2X Quick Ligase Buffer (NEB) X ul ddH2O 10 ul subtotal 1 ul Quick Ligase (NEB M2200S) 11 ul total 阴性对照：使用ddH2O代替Oligos
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转化
使用Stbl3感受态
慢病毒转染质粒包含Long-TerminalRepeats (LTRs) ，感受态细胞选择重组缺陷型的细菌以提高转化效率 。
