前言：

大家都知道CRISPR-Cas9有脱靶效应，并且每个sgRNA的效率都不一样的，因此在做正式实验之前，我们要验证sgRNA的效率，之后优中选优。还是那句话，同样的目的有很多不同的方案，我了解到的有：

1. 使用sgRNA靶点筛选试剂盒，优点快速、工作量小且可以大批量进行；
2. 将sgRNA-pSpCas9转入293细胞中，提取293细胞基因组DNA，PCR扩增目的DNA片段后，使用T7核酸内切酶，验证sgRNA切割效率；

欢迎大家补充，互相交流，提供更方便快捷的方案，由于我们实验室购买试剂盒时间长，相对困难，且sgRNA的切割效率的验证还是活细胞内效率最为准确。经过课题组师兄DZ的优化，一般我们针对一个基因的简单敲除，设计2个sgRNA即可，并且选择方案2进行验证。

接前期推文，我们做了一手漂亮的质粒转染后，如何确定sgRNA切割活性，这条sgRNA到底还要不要，就看今天了。

实验正文

1. 实验准备

细胞：已转染sgRNA-pSpCas9质粒的293细胞，转染效率70%以上。

试剂准备：<u>T7 Endonuclease I</u> 核酸内切酶及相应buffer，基因组DNA提取试剂盒，目的基因片段primers，NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶（其他公司的高保真DNA聚合酶也可以，一定要高保真），琼脂糖凝胶电泳相关试剂，胶回收试剂盒

仪器：琼脂糖凝胶电泳仪，看胶仪

2. 实验步骤

（1）293细胞转染

在转染前一天，将293细胞以单细胞分散状态种至6孔板中，组别设计为：293未转染组（negative control），293转染组。转染当天293细胞融合度为30_40%，将2.02.5 μg pSpCas9_sgRNA质粒使用lipofectamine 3000按照常规条件转染（具体细节请参照上期文章），72 h内进行下一步实验。

注意事项：由于293细胞贴壁不牢，很容易被吹落，因此在滴加转染试剂的时候要十分轻柔，换液时要更加小心沿壁加入，并且培养基要提前预温。

（2）提取293细胞基因组DNA

这里我们使用的是天根公司的基因组DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒要求即可。

实验细节调整：原protocol可能需要消化细胞后再加裂解液，在这里由于293细胞非常容易脱落，因此我选择不消化细胞，弃去上清，直接使用孔种的培养基吹落细胞，移入1.5 ml EP管离心去除上清后，直接加入裂解液吹打，之后步骤同试剂盒要求一样。

（3）使用高保真DNA聚合酶完成PCR实验

一定要使用高保真酶的原因是，T7 EI内切酶的原理是识别突变位点，所以如果使用的DNA聚合酶不够保真，在PCR过程扩增错误，引入突变，则会影响后续结果。在这里需要提醒的是，任何DNA聚合酶的使用，一定要严格查阅相应说明书，确定实验条件。我们使用的是NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，根据说明书指示，Q5 DNA聚合酶做的PCR实验，其primer的退火温度和普通我们使用的不一样，需要使用NEB公司的Tm calculator工具计算得出。

（4）胶回收PCR扩增出的目的序列
胶回收的原则就是，量大质优，严格按照说明书操作即可。

（5）T7 Endonuclease I 酶切实验
配置实验反应

image.png

按照以下条件annealing

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设置酶切反应后，37 ℃孵育15分钟

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（6）琼脂糖凝胶电泳，预测分子量大小<1 kb，使用 1.5_{2%琼脂糖；分子量大小为1}10 kb大小时，选用1-1.2%

（7）结果分析示例

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对于左图
（1）可以看到negative control组中，T7酶并没有将DNA切断，可以说明没有出现基因错配的情况；
（2）而分别用了sgRNA 1 和sgRNA 2的两组，均出现了DNA被切割的现象，且切割后的片段长度加起来，恰好等于uncut line。
以上结果说明，在未转染sgRNA-Cas9组（NC）中，DNA保持了原有的正确序列，转染sgRNA-Cas9质粒后的细胞，基因已经被编辑。sgRNA 1和2均可切割，且量条sgRNA的效率差不多，随手选一条即可。

右图是更加标准的做法，左图少了blank control 组（不加T7 酶的组）。

小结

CRISPR-Cas9基因编辑的直接敲除系列，今天写到这里算是完成了预实验部分。这个时候可以把整个方案的流程放在这里权当总结，并提示之后实验方向方向：

image.png

准备工作和预实验要至少得到以下简化的实验结果：

flowchart