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Title:

The Role of Non-coding RNAs in Oncology

Abstract:

Meta Translation

标题：非编码RNA在肿瘤学中的作用

作者：弗兰克·J·斯拉克；阿鲁尔·M·钦内亚安；B·D·亚当斯；A·L·卡辛斯基；F·J·斯拉克；B·D·亚当斯；C·帕森斯；F·J·斯拉克

摘要：本文综述了非编码RNA在肿瘤学中的重要作用。非编码RNA是一类不参与编码蛋白质的RNA分子，包括长链非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）以及环状RNA（circRNA）。近年来的研究表明，非编码RNA在肿瘤的发生、发展和转移过程中起着关键作用。它们能够调控基因表达、细胞增殖、凋亡、侵袭和转移等肿瘤相关过程。因此，深入研究非编码RNA的作用机制和功能对于肿瘤学的研究具有重要意义。本文总结了已有的研究成果，并展望了未来研究的方向和潜在应用领域。

非编码RNA在肿瘤学中的作用

几十年来，对癌症生物学的研究主要关注蛋白质编码基因的参与。直到最近才发现，一整个类别的分子，被称为非编码RNA（ncRNA），在塑造细胞活动中起着关键的调节作用。对ncRNA生物学的大量研究表明，它们代表了一组多样且普遍存在的RNA，包括致癌分子和抑制肿瘤的分子。因此，已经开始了数百项以ncRNA作为新型生物标志物或治疗方法的针对癌症的临床试验，这可能只是个开始。

尽管现在是生物医学科学中最热门的话题之一，但非编码RNA（ncRNA）的重要性直到最近才被广泛认识。一度，人们认为RNA主要是作为使其他分子（如核糖体）能够利用编码在DNA中的指令制造蛋白质的信使。然而，在过去的30年里，研究人员发现存在多种类型的RNA，其中最重要的是ncRNA-不参与蛋白质合成的类型。数以万计的ncRNA物种的发现彻底改变了领域的研究方向，改变了研究人员对生理学和疾病发展的思考方式（Adams等，2017年；Bartel，2018年；Evans等，2016年；Rupaimoole和Slack，2017年）。 ncRNA占据了人类基因组产生的RNA中的90%以上，但大多数超过50,000种已知的ncRNA是在过去的10年中发现的，并且仍然没有得到充分研究（Deveson等，2017年；Esposito等，2019年；Kopp和Mendell，2018年；Ransohoff等，2018年）。

尽管如此，已经有许多ncRNA被证明在正常细胞功能和疾病（包括癌症）中发挥关键作用，这些信息正在积极地应用于临床实践。一些稳定性很高的小型ncRNA在血液中存活下来，可能成为几滴血液中重要人类癌症的准确敏感筛查的基础（Yaman Agaoglu等，2011年；Imaoka等，2016年；Toiyama等，2013年）。此外，ncRNA可以被治疗性地靶向，并且ncRNA的传递可以基于已有的传递RNAi和靶向编码蛋白质mRNA的寡核苷酸的基础（Levin，2019年；Pecot等，2011年；Wu等，2014年）。事实上，RNA药物领域经历了复兴（Levin，2019年），最近获批了第一种RNAi药物Onpattro（patisiran；用于治疗遗传性转铁蛋白淀粉样变性的TTR水平）（Adams等，2018年），以及RNA靶向寡核苷酸药物Spinraza（nusinersen；用于增加治疗神经肌肉疾病脊髓性肌肉萎缩的全长SMN2水平）的临床成功（Wurster等，2019年）。此外，基于一类称为微小RNA(miRNA)的ncRNA的药物的临床试验也已经开始用于癌症（Beg等，2017年；Seto等，2018年；van Zandwijk等，2017年）。

在本综述中，我们将讨论ncRNA与癌细胞生物学的关系以及它们与当前临床实践的相关性。我们首先审查不同类别的ncRNA（miRNA、转移RNA [tRNA]衍生的小RNA [tsRNA]、PIWI相互作用RNA [piRNA]、长非编码RNA [lncRNA]、假基因和环状RNA [circRNA]）的复杂性并提供这些分子在影响癌症过程中所起的广泛作用的基本示例。然后，我们讨论这些ncRNA生物学的基础科学洞见如何被用于开发癌症的下一代诊断和治疗方法。随着所谓的“基因组黑暗物质”不断被揭示，可以明显看出，靶向ncRNA信号传导在对癌症患者的护理中具有巨大的潜力。

Overview of Classes of ncRNAs and Their Association with Cancer

ncRNA在肿瘤学中的作用

数十年来，基因组中微小的编码蛋白质部分一直是医学研究的主要焦点。人类基因组测序显示，仅有2%的基因最终编码蛋白质，许多科学界的人认为剩下的98%只是一种功能上无用的“垃圾”(Mattick and Makunin, 2006; Slack, 2006)。然而，ENCODE项目揭示了基因组的非编码蛋白质部分被转录成了成千上万个RNA分子(Djebali et al., 2012; Gerstein et al., 2012)，它们不仅调控生长、发育和器官功能等基本生物过程，而且似乎在整个人类疾病的谱系中起着至关重要的作用，尤其是在癌症方面(关于最近的综述，请参见Adams et al., 2017; Deveson et al., 2017; Rupaimoole and Slack, 2017)。开创性的研究使我们了解到ncRNA分子在基因的编码、解码、调控和表达中扮演多种重要角色，以及它们如何相互通讯(Anastasiadou et al., 2018b; Esquela-Kerscher and Slack, 2006; Gregory and Shiekhattar, 2005; Huarte and Rinn, 2010; Kasinski and Slack, 2011; Krichevsky et al., 2003; Rinn and Huarte, 2011; Tay et al., 2014)。这些关于ncRNA调控作用的知识揭示了基于互补碱基配对的特定ncRNA网络在不同类型的癌症中发挥作用(Anastasiadou et al., 2018b)，进而为该领域的科学家们提供了开发以人类基因组为基础的特定癌症治疗和预防策略的可能性(关于最近的综述，请参见Cieslik and Chinnaiyan, 2018; Rupaimoole and Slack, 2017)。

癌症的特征是细胞不受控制地增殖, 能够扩散到其他组织和失去通过细胞死亡有序过程(凋亡)的能力。ncRNA的发现增加了对癌症如何发展和可能治疗的理解，通过提供了了解基因组其余部分影响的窗口。破坏的ncRNA表达及随后的下游信号转导过程，在癌症发展和进展中被直接证实。编码ncRNA基因的遗传变异与癌症相关；然而，与编码蛋白质的基因相比，迄今为止，研究中遗传变异的例子要少得多。最著名的例子可能是慢性淋巴细胞白血病(CL)中13q14.3的缺失，这导致miR-15/16肿瘤抑制基因的删除(Calin et al., 2002)。反过来，放大癌基因性ncRNA编码的染色体区域也在癌症中发现，其中包括扩增lncRNAs FAL1 (Hu et al., 2014)和PVT1 (Tseng et al., 2014)。lncRNA H19 (Hua et al., 2016)、ANRIL (Pasmant et al., 2011)和CCAT2 (Ling et al., 2013)基因中的单核苷酸多态性(SNPs)也与癌症发展的风险相关联。除了转录区域内的遗传变异外，ncRNA启动子的突变也可能导致基因表达水平的改变，例如乳腺癌中lncRNAs NEAT1和RMRP启动子的重复驱动突变(Rheinbay et al., 2017)。除了这些基因机制，与癌症相关的ncRNA的上下调节可以通过表观遗传、转录或转录后的过程发生(关于最近的综述，请参见Adams et al., 2014; Anastasiadou et al., 2018a; Rupaimoole and Slack, 2017)。

ncRNA可以根据其大小分为不同的类别。在癌症中重要的小ncRNA包括miRNA、tsRNA和piRNA。在大小谱系的另一端是长链非编码RNA(lncRNA)，其特征是未翻译的RNA长度大于200个核苷酸，其中包括假基因和环状RNA(circRNAs)等子类。

MicroRNAs

微小RNA

在千禧年之交，通过对秀丽隐杆线虫(C. elegans)的发育研究，首次发现了miRNA的两个成员lin-4和let-7 (Lee等，1993；Reinhart等，2000)。miRNA是长度为22个核苷酸的短链非编码RNA，通过与靶向RNA中与之互补的5'端（称为“种子”）结合来调控其他RNA（尤其是mRNA）的表达。miRNA的基因通过RNA聚合酶II (Pol II) 转录，并通过一个在进化中保守的途径进行加工。在典型的加工途径中，这个较长的初级转录产物（称为pri-miRNA）形成一个特征性的发夹结构，被微处理体复合物（由Drosha和DGCR8组成）识别并剪切为长度为60个核苷酸的预miRNA，然后通过Exportin 5和Ran-GTP复合物被输出到细胞质。预miRNA的两端随后由Dicer酶剪切，形成miRNA成对结构，这个成对结构的5'端是磷酸酯，每个3'端有2个核苷酸的突出部分。miRNA双链中的一个链条，即导引链，被加载到Argonaute蛋白中，并选择形成含有成熟22个核苷酸miRNA的RNA诱导沉默复合物 (RISC)（可参考Anastasiadou等最新综述，2018a；Bartel，2018）。成熟的miRNA通过与mRNA的3'非翻译区（3' UTR）结合，抑制其降解或转化抑制来发挥功能 (Bartel，2018；Esquela-Kerscher和Slack，2006)。多项研究试图对不同物种中的miRNA数量进行注释。对于人类，miRBase v22给出的更高估计将成熟miRNA的数量放置在2,654个，但是来自其他数据库例如MirGeneDB2.0的算法将这个数字减少到588个高可靠性miRNA (Fromm等，2015；Kozomara等，2019)。尽管其绝对数量存在差异，但miRNA在下游过程中的影响显而易见，因为超过60%的编码基因是miRNA的潜在靶点 (Friedman等，2009)。此外，数百个miRNA的种子区域在不同物种间具有保守性（Bartel，2018），这表明它们在动物的发育或生理过程中具有关键作用。

关于癌症，miRNA提供了一个发现新的遗传风险因素的强大途径 (Ryan等，2010)。在小型非编码RNA物种中，与tsRNAs和piRNAs相比，miRNA在癌症研究中被广泛研究。miRNA在所有研究过的癌症类型中都发现有改变 (Volinia等，2006)，并且已经证明miRNA的变化在影响癌症状态的分子和细胞过程中发挥了关键作用 (Esquela-Kerscher和Slack，2006；Nicoloso等，2009)。尽管研究人员仍在学习miRNA对癌症贡献的程度，但这些小型非编码RNA似乎以两种方式发挥作用 - 作为抑癌基因或促癌基因（常称为onco-miRs），促进癌症生长或转移 (Rupaimoole和Slack，2017)。尽管小型，miRNA非常强大，每个分子通常能够调控多个靶点，反之亦然，mRNA通常受到多个miRNA的靶向（Bartel，2018）。因此，miRNA作为主要调控因子，控制着成千上万的编码和非编码基因的表达。

Oncogenes

非编码RNAs在肿瘤学中的作用

研究表明，miRNAs可以作为癌基因发挥作用，促进异常细胞生长并有助于肿瘤形成。这些miRNAs可以直接抑制肿瘤抑制基因的活性，或者通过间接作用去除对癌基因活性的遗传制动。例如，miR-155可以促进异常B细胞增殖，引发一系列变化，最终导致白血病和淋巴瘤的发展（Babar等，2012年；O'Connell等，2009年）。值得注意的是，传递靶向miR-155的抗miRs可以抑制肿瘤生长（Babar等，2012年；Cheng等，2015年）（图1A）。另一个miRNA，miR-21，在前B细胞淋巴瘤中过度表达，并且与其他癌症（如肺癌）有关，通过靶向Ras信号的负调控因子（Hatley等，2010年；Medina等，2010年）。在胶质母细胞瘤中，一个致癌miRNA，miR-10b，在表达水平上高于正常脑组织，并且对肿瘤生长起到必需的作用（El Fatimy等，2017年）。这些致癌miRNAs表现出癌基因成瘾（致癌miRNA成瘾）的现象，因为肿瘤依赖于持续表达miRNAs来求生（Cheng和Slack，2012年），因此在抗癌治疗中是重要的潜在靶点。最近，研究证明了以个体患者肿瘤中独特过度表达的致癌miRNAs为靶点的潜力，从而打开了个体化miRNA治疗的途径，这在我们的综述末尾进行了讨论（Gilles等，2018年）。

Tumor Suppressors

肿瘤抑制基因

研究表明，非编码RNA（miRNAs）也可以作为肿瘤抑制基因，一旦它们的功能丧失，其保护作用也会消失。
例如，保守的miRNA let-7抑制了RAS基因家族，该基因家族与约三分之一的人类癌症有关（Johnson等，2005(Johnson等，2007)）。因此，let-7的表达可以降低RAS的水平，表明它具有肿瘤抑制作用，并可作为一种新的有希望的治疗药物（Trang等，2010(Trang等，2011)）。另一个例子是miR-15a和miR-16-1通常起到肿瘤抑制作用，但当突变或缺失时，与慢性淋巴细胞白血病（CLL）的发生相关（Calin等，2002(Calin等，2005;;Klein等，2010)（图2A）。此外，miR-34a是miR-34 miRNA家族的一个成员，这是一种保守且冗余的miRNA家族（Concepcion等，2012），调节了多个癌基因的表达，并且是p53的直接下游靶基因（Adams等，2016a(Adams等，2016b;;Kasinski和Slack，2012;Liu等，2011)。这些miRNAs在其他类型的癌症中也失活，如多发性骨髓瘤，滑膜B细胞淋巴瘤和前列腺癌（Volinia等，2006）。

Context-Dependent

依据上下文，一些miRNAs在不同环境下可以作为肿瘤抑制因子或癌基因发挥作用。一个显著的例子是miR-29，它在慢性淋巴细胞白血病的慢进展形式中有助于疾病的防止，但在急性髓系白血病和更侵袭性的淋巴细胞白血病中升高，这意味着该miRNA也可以作为一个癌基因发挥作用。(Pekarsky和Croce，2010年)。
只在过去的十年中，我们发现了一组与临床相关的小型非编码RNA，它们来源于tRNA，我们统称之为tRNA衍生小型RNA(tsRNAs) (Cole等，2009年；Lee等，2009年); 这些分子也被称为tRNA片段(tRFs)或tRNA衍生的压力诱导RNA(tiRNAs)。它们的许多生成和下游机制仍然在解开之中，同时还在实施一个通用命名系统。转移RNA由RNA Pol III转录为前tRNA，然后经过修饰和处理过程产生成熟tRNA。一个tRNA可以产生不同类型的tsRNAs，取决于切割发生的位置以及它是在前tRNA转录本还是成熟tRNA中。产生tsRNAs的酶仍在完全揭示中，但在某些情况下已经注意到核糖核酸酶如Angiogenin、Dicer和RNase Z的作用(参见Balatti等最近的综述，2017年；Kumar等，2016年；Saikia和Hatzoglou，2015年)。已经构建了几个tsRNA数据库来辅助对这一新型小型非编码RNA类别的表征。MINTbase v2.0分析了全部癌症组织的The Cancer Genome Atlas (TCGA)数据集，并从中识别了26,531个独特的tsRNA序列(算法中仅包括从成熟tRNA产生的片段) (Pliatsika等，2018年)。尽管癌细胞中存在着令人印象深刻的不同tsRNA分子数，以及一些独特的作用机制，但在某些方面，tsRNAs与miRNAs有重叠之处。像miRNAs一样，tsRNAs与Argonaute蛋白质相关联，可以通过结合靶向mRNA的3'UTRs介导mRNA的转化抑制，并且既可以具有致癌作用也可以是肿瘤抑制因子 (Goodarzi等，2015年；Kuscu等，2018年；Maute等，2013年)。最近的一项令人兴奋的研究发现，一种来源于亮氨酸tRNA的tsRNA在全局蛋白质翻译调控中发挥作用(图1B，表1)。值得注意的是，研究人员展示了这种tsRNA在肝肿瘤中被上调，并且通过在体外和体内使用LNA寡核苷酸靶向tsRNA，导致肝肿瘤细胞发生细胞死亡(Kim等，2017年)。这些结果表明，tsRNAs是另一个可能的抗癌治疗靶点。

PIWI-Interacting RNAs

PIWI-相互作用RNA（piRNAs）是一类长度为21-35个核苷酸的小RNA，通常与PIWI亚家族的Argonaute蛋白和生殖细胞发育中的转座子沉默相关（Aravin等，2006年；Girard等，2006年）。对于piRNA前体的生成存在物种特异性的途径，而piRNA序列并不十分保守。在哺乳动物中，piRNAs是从长的单链转录本中加工而来的，它们的基因位点在基因组中呈簇状分布，并由RNA Pol II转录，人类基因组中存在20,000个piRNAs（Ng等，2016年）。如上所述，为了发挥作用，miRNA与广泛表达的AGO蛋白家族结合。相反，正如其名称所暗示的，piRNAs被加载到PIWI蛋白家族的蛋白上，后者通常局限于生殖细胞。piRNAs的经典功能是沉默转座子，它们通过两种方式实现。首先，piRNAs引导PIWI蛋白定位于新生转座子转录本，并在目标转座子启动子处产生抑制性染色质状态以抑制其转录。其次，piRNAs引导PIWI复合物定位于转座子mRNA，从而剪切该转录本（参见Ng等的最新综述，2016年；Ozata等，2019年）。虽然传统上认为piRNAs仅在生殖细胞中发挥功能，但最近的研究表明，在某些成体组织中也表达了数万个piRNAs，尽管表达水平非常低，并且在癌症中被错误表达，这表明这些小的非编码RNA也可能是有用的生物标志物（Martinez等，2015年；Mei等，2015年；Ng等，2016年）。然而，piRNAs在成体组织和癌症中的功能角色仍在阐明中。

Long ncRNAs

长链非编码RNA（lncRNAs）章节：

最早被发现的一些lncRNAs是XIST和H19（Bartolomei等人，1991；Brown等人，1991）。尽管最初是通过研究X染色体失活和胚胎发育来确认它们，但现在这两个基因已经成为与多种类型癌症机制相关的lncRNAs列表中的一部分。lncRNAs是由RNA Pol II从独立启动子转录出的长度大于200个碱基的非编码转录本。与编码蛋白质的基因类似，它们的基因组位置标志着H3K4三甲基化在转录起始位点的富集以及整个基因体的H3K36三甲基化。lncRNA转录本包含多个外显子，这些外显子通过规范机制剪接到成熟转录本中，通常包含5'帽和3'多聚尾巴。然而，与编码蛋白质的转录本相比，lncRNAs的外显子较少，总体上表达水平较低（Cabili等人，2011；Derrien等人，2012；Iyer等人，2015）。有趣的是，lncRNAs在进化上也不高度保守，只有5％-6％的lncRNAs含有保守序列（Iyer等人，2015）。关于这一点，有一种观点认为高度保守的lncRNAs可能更有可能是功能性的。然而，还有一些可能参与疾病过程的灵长类特异lncRNAs。RNA测序（RNA-seq）显示，与编码蛋白质的基因相比，独特的lncRNA转录本数量要多得多。最近的一项广泛的以癌症为中心的研究MiTranscriptome分析了7256个RNA-seq库，主要来自人类组织（5298个原发肿瘤、281个转移灶和701个正常/良性组织），并鉴定出58648个lncRNAs。此外，这些数据集还允许对癌症中lncRNAs的全面探索，并导致了7941个癌症和/或谱系特异的lncRNAs的鉴定（Iyer等人，2015）。

与小型ncRNAs相比，lncRNAs展现出广泛的机制多样性来发挥它们的功能角色，因此在这个领域需要进行更详细的讨论。lncRNAs可以通过cis或trans方式发挥作用，即它们介导靠近它们自己的转录位点附近的局部效应（cis），或者在远离基因组或细胞位置（trans）上发挥作用。已经表明不同的lncRNAs能够影响基因表达的各个层面——表观遗传、转录和转录后。多种lncRNAs将其他调节分子（例如mRNAs、miRNAs、DNA）与蛋白质（例如染色质修饰复合物、转录因子、E3连接酶、RNA结合蛋白）靠近彼此，并且形成一个灵活的分子框架，促进维持细胞活性所必需的化学相互作用（参见Anastasiadou等人，2018b；Kopp和Mendell，2018的最新综述）。

就lncRNAs直接与蛋白质复合物结合发挥功能的机制而言，其中一个最为典型的机制是将染色质修饰复合物引导到靶向基因启动子，以影响转录抑制/激活。值得注意的例子包括以下情况：HOTAIR结合PRC2和LSD1/ CoREST/REST在其5 '和3'末端，以将复合物定位到启动子并调节组蛋白甲基化水平（Tsai等人，2010）；SChLAP1是一种侵袭性前列腺癌特异性lncRNA，直接与SWI/SNF核小体重塑复合物相互作用（Prensner等人，

长链非编码RNA（lncRNA）在肿瘤学中的作用

lncRNA的一个常见作用是与其他蛋白质互作来调控基因表达。例如，ANRIL与PRC1和PRC2的成分相互作用，用于沉默CDKN2B/2A肿瘤抑制基因簇中的基因（Yap等，2010）。lncRNA通常还会与转录因子结合，从而在细胞转录程序上产生广泛的下游效应。有趣的是，GAS5 lncRNA作为糖皮质激素应答元件（GRE）的模拟物，直接与糖皮质激素受体（GR）的DNA结合结构域结合，阻止其激活目标基因，包括阻止凋亡的基因（Hudson等，2014; Kino等，2010）。其他直接相互作用的伙伴包括 PANDA和NF-YA转录因子，它们是调控p53靶向细胞死亡基因的重要激活因子（Hung等，2011），PCGEM1增强c-Myc作为代谢的主要调控因子的活性（Hung等，2014），NKILA直接与NF-KB/IKB复合物结合以阻止IKK对IKB的磷酸化（Liu等，2015），以及DINO与DNA损伤后的p53相互作用并稳定其（Schmitt等，2016）。lncRNA通常也与调控mRNA加工和稳定性的RNA结合蛋白（RBP）直接接触。HOTAIR的作用通过与hnRNPA2/B1结合来实现，它们作为'' 媒婆'' 将HOTAIR/PRC2靶向到mRNA转录本（Meredith等，2016）。最近，发现了一种新型超保守的lncRNA THOR，并证明其通过稳定IGF2BP1与目标mRNA的结合以发挥癌基因的功能（Hosono等，2017）（图1C）。最后，lncRNA还可以作为核内颗粒和伴核颗粒中调控分子的支架，这可以通过lncRNA NEAT1和MALAT1来示例（Clemson等，2009; Tripathi等，2010）。

除了蛋白质外，lncRNA还可以直接结合核酸来介导其分子机制。其中两个有趣的例子是最近发现的与前列腺癌中的AR mRNA相互作用以调控其细胞质水平的lncRNA ARLNC1（Zhang等，2018），以及直接与JUNB和CTNNB1转录本结合以抑制其翻译的LincRNA-p21（Yoon等，2012）。另一种常见的机制是lncRNA作为竞争性内源性RNA（ceRNA）或 ''海绵'' 与miRNA相互作用。其中较早被发现的一种lncRNA H19作为几个肿瘤抑制miRNA的诱饵，其中包括let-7（Kallen等，2013）。已经证明TUG1作为miRNA的诱饵，在前列腺癌中靶向PTEN的miRNA（Du等，2016），以及那些可靶向SOX2和MYC的脑胶质瘤细胞（Katsushima等，2016）方面具有作用。此外，还发现lncRNA可以与DNA直接相互作用。靶向转化生长因子b（TGF-b）信号通路中的基因启动子的GA富集结构吸引MEG3 lncRNA的GA富集序列通过RNA-DNA三重螺旋结构形成，并通过与MEG3的相互作用而将PRC2招引过来（Mondal等，2015）

长链非编码RNA (lncRNAs) 在肿瘤学中的作用

考虑到广泛的调控机制和对下游通路的多样性影响，不足为奇的是，许多包括上述几个在内的lncRNAs已经通过体内实验证明是癌症进展的重要贡献者，并且代表了可能的治疗靶点（表1）。由于它们在物种上的保守性较差，大多数这些研究依赖于调节在转移至小鼠的人类癌细胞系中lncRNAs的表达。与miRNAs一样，lncRNAs已被发现既可以作为肿瘤抑制子，也可以作为癌基因，或者显示出与环境相关的作用（表1）。

癌基因：许多已经阐明其细胞功能的lncRNAs是作为促进肿瘤生长的癌基因，并且通常在癌症中过度表达。HOTAIR是最为研究充分的一种致癌性lncRNA，最初被描述为HOX基因家族的调控因子，这些基因有助于控制细胞特性（Rinn et al., 2007）。然而，很快发现HOTAIR在通过靶向PRC2和LSD1/CoREST/REST控制基因抑制方面具有更广泛的作用（Gupta et al., 2010；Tsai et al., 2010）。HOTAIR过表达与乳腺癌以及其他一些癌症的不良预后有关，可能通过增加转移和肿瘤浸润性来实现（Balas and Johnson, 2018；Bhan et al., 2017；Gupta et al., 2010；Li et al., 2016b）。近年来，又有几种新的致癌性lncRNAs在功能上得到描述，包括之前提到的THOR（Hosono et al., 2017）（图1C）和ARLNC1（Zhang et al., 2018），以及SAMMSON（Leucci et al., 2016）、DSCAM-AS1（Niknafs et al., 2016）、lncARSR（Qu et al., 2016a）、CamK-A（Sang et al., 2018）和EPIC1（Wang et al., 2018）（表1），这个列表无疑还会继续增长。特别是SAMMSON最近引起了很多关注，作为一种仅在黑色素瘤中存在的lncRNA，它在细胞生长和存活中是不可或缺的，无论 TP53、BRAF 或 NRAS 的突变状态如何（Leucci et al., 2016）。在机制上，SAMMSON通过与帮助平衡细胞质和线粒体中核糖体RNA（rRNA）成熟与蛋白质合成的p32、CARF和XRN2蛋白相互作用来促进细胞生长（Leucci et al., 2016；Vendramin et al., 2018）。重要的是，在患者来源的移植瘤模型（PDX）中，通过GapmeR静默SAMMSON可以抑制肿瘤生长，显示出这种lncRNA的治疗潜力（Leucci et al., 2016）。

肿瘤抑制子：一些lncRNAs通过阻止增殖、激活凋亡、维持基因组稳定性或促进肿瘤抑制子表达等方式，起到预防癌症发展的保护作用。例如，MEG3是最为研究充分的抑癌性lncRNA之一。除了上述调控TGF-β通路外，MEG3还通过下调MDM2表达和增加p53蛋白水平（图2B）来调节这些和其他通路，从而导致细胞增殖减少（Lu et al., 2013；Mondal et al., 2015；Zhang et al., 2010；Zhou et al., 2007）。

Long ncRNAs (lncRNAs) play an important role in oncology. In the case of MEG3, which acts as a tumor suppressor, it is often observed that there is a loss of copies of the MEG3 gene and an increase in CpG methylation of its promoter in cancers (Balas and Johnson, 2018; Zhang et al., 2010). GAS5 is another lncRNA that has known tumor suppressive roles and is often downregulated in cancers. In vivo experimental evidence in breast and glioblastoma models has demonstrated its direct involvement (Bhan et al., 2017; Zhang et al., 2013; Zhao et al., 2015). Besides its effect on GR signaling, GAS5 also interacts with miRNAs, which can ultimately lead to decreased cell proliferation and increased apoptosis, as well as decreased migratory potential (Hudson et al., 2014; Kino et al., 2010; Zhang et al., 2013; Zhao et al., 2015).

Context-Dependent

在肿瘤学中，许多长链非编码RNA（lncRNA）显示出抑癌和致癌功能。例如，在乳腺癌中，lncRNA NKILA 负向调节核因子κB（NF-κB）信号传导和下游炎症。在过表达NKILA的人类乳腺癌细胞系的小鼠异种移植模型中，这导致转移减少和存活率增加，暗示了一个抑癌作用（Liu 等，2015）。然而，最近也有研究表明，增加的NKILA可以通过诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）和T H 1细胞的激活诱导细胞死亡，促进肿瘤免疫逃避，具有致癌特性（Huang 等，2018）。

Pseudogenes

赝基因是一类与编码基因序列相似但已失活且不再产生功能蛋白的lncRNA转录本亚类。RNA-seq研究发现，基因组中表达了成千上万的赝基因，其中许多被证实特异性表达于特定的癌症类型(Kalyana-Sundaram等人，2012)。尽管赝基因有时被认为是无用的进化遗迹，但研究表明它们发挥着重要的功能，并且既可以保护免受癌症的影响，也可以促进癌症的发展。赝基因的一个功能是充当诱饵，将miRNA和其他分子从它们的编码基因对应物中转移开。PTENP1赝基因和一个功能强大的肿瘤抑制因子编码基因PTEN在大小和结构上几乎完全相同。当正常发挥作用时，赝基因PTENP1可以充当诱饵来捕捉原本会降低PTEN产生的miRNA (Poliseno等人，2010;Yu等人，2014;Zheng等人，2018) (图2C)。通过以ceRNA的方式发挥作用，PTENP1赝基因就可以发挥肿瘤抑制作用(Table 1)。其他赝基因ceRNA可能促进癌细胞的生长。最近，在小鼠模型中发现，赝基因BRAFP1异常水平会导致激进性B细胞淋巴瘤。当高表达时，这个赝基因作为miRNA诱饵，增加了BRAF蛋白的数量(Figure 1D)。事实上，具有异常赝基因的小鼠和表达编码对应物BRAF癌基因的小鼠一样快地发展出癌症(Karreth等人，2015)。这表明，赝基因远非"死亡"基因，可能直接参与了癌症的发展。虽然研究才刚刚起步，但它越来越清楚，赝基因在生理和癌症中的活跃度比以前被认识的更高。

Circular RNAs

在lncRNA组中还包括circRNAs，顾名思义，它们是单链的共价闭合RNA分子。这些分子通常是通过反向剪接过程产生的，但circRNA产生的确切机制尚未完全阐明。然而，已经表明circRNA的母基因表达不是circRNA表达的预测因子。与circRNAs相关的因素似乎是较长的内含子长度和内含子重复和反向互补元素的增加（Chen et al., 2019;Ivanov et al., 2015;Jeck et al., 2013;Vo et al., 2019）。近几年出现了几个关于细胞系中circRNAs的数据库，但只有最近才进行了直接在临床样本中鉴定circRNA物种的研究。在一项研究中，对2000多个临床肿瘤样本进行了circRNA的全面分析，涉及40多个癌症部位，从而生成了MiOncoCirc数据库。值得注意的是，这些努力鉴定出了超过160,000个明显表达的circRNAs（Vo et al., 2019）。另一项最近的研究，特别是在局部前列腺癌中，通过对前列腺肿瘤标本进行RNA-seq鉴定了76,311个circRNAs（Chen et al., 2019）。综合来看，这些研究表明了癌症中circRNA的高普遍性。有趣的是，整体全球circRNA的丰度已被证明与细胞增殖呈负相关（Bachmayr-Heyda et al., 2015;Vo et al., 2019）。

尽管circRNAs有广泛的表达，但大多数作用机制和功能角色仍在探索中。对那些功能研究过的少数circRNAs进行了描述，它们的机制与其他lncRNAs类似，还可以作为致癌基因或抑癌基因发挥功能（Table 1）。作为一种作用机制，与lncRNAs类似，circRNAs被发现可以吸附miRNAs，例如circCCDC66在结直肠癌中具有致瘤功能（Hsiao et al., 2017），circHIPK3在膀胱癌中发挥抑瘤作用（Li et al., 2017）（Figure 2D）。circRNAs与miRNAs的相互作用也可能起到稳定miRNA结合伴侣的功能，最近的研究表明，在前列腺癌中发生了circCSNK1G3和miR-181之间的结合，导致细胞增殖增强（Chen et al., 2019）。circRNAs还被提议能够直接与蛋白质结合，要么作为复合物组装的支架，例如circCTNNB1和DDX3（Yang et al., 2019）（Figure 1E），要么吸附感兴趣的蛋白质以阻止其介导其作用（Kristensen et al., 2018）。还需要注意的是，虽然我们已经在非编码RNA的背景下讨论了circRNAs，但也有研究表明一些circRNAs可能会被翻译（Legnini et al., 2017;Pamudurti et al., 2017）。虽然关于circRNAs的功能研究和治疗潜力的评估还处于起步阶段，但明显的是circRNAs具有较强的稳定性（Vo et al., 2019），使其成为新型癌症生物标志物的理想候选，下文将进一步讨论该问题。

Clinical Relevance of ncRNAs

非编码RNA在临床上的相关性

通过在http://clinicaltrials.gov数据库中使用与非编码RNA相关的关键词进行搜索，可以找到数百项涉及非编码RNA的临床试验（表S1），其中很多是癌症试验，而绝大多数（超过800项）是涉及miRNA的。鉴于非编码RNA具有高度特异性的检测方法和组织特异性以及大量的发现性研究支持数据，不足为奇的是，绝大多数这些试验都是诊断性的，其中非编码RNA被用作疾病状态的生物标志物或疾病结果的预后标志物。然而，由于RNAi和寡核苷酸药物的最近成功（Levin，2019；Pecot et al。，2011），一些涉及非编码RNA的治疗性临床试验已经开始（Rupaimoole和Slack，2017），尽管成功度参差不齐。下面，我们将重点介绍一些目前正在进行中或刚刚完成的值得关注的非编码RNA诊断和治疗癌症试验，并有可能对患者护理产生影响。

非编码RNA作为癌症生物标志物

非编码RNA是有用的分子生物标志物，因为在不同类型的癌症中观察到非编码RNA表达的异常。在临床前的大规模发现研究中，已经展示了非编码RNA作为诊断和预后生物标志物的潜力，表2中概述了一些重要的例子。这些重要的例子可以在短（miRNA）和长（lncRNA、circRNA）非编码RNA类中找到。尽管对它们的功能描述刚刚开始，但circRNA是一类特别有趣的标志物，因为它们具有增强的稳定性，这是由于具有内部还原核酸酶抵抗性的闭合末端（Schwanha ¨usser et al。，2013；Vo et al。，2019）。重要的是，如表2所示，一些生物标志物可以在血液或尿液中找到，相对于获取肿瘤活检样本而言，采集过程更少侵入性。给定生物标志物的表达可以检测到与正常样本相比的癌症存在，或者在发现癌症后预测生存、转移或治疗反应。

ncRNAs在肿瘤学中的临床相关性

在表2中列出的生物标志物中，PCA3是迄今为止唯一获得美国食品药品监督管理局（FDA）认可的ncRNA作为癌症生物标志物测试的标志物。PCA3是一种常在前列腺癌中过表达的前列腺特异性标志物，并且很重要的是，可以通过非侵入性尿液采集方便地检测到（Hessels等，2003）。当与尿液中经常在前列腺癌中过表达的另一转录本TMPRSS2:ERG水平相结合时，PCA3的诊断能力更强（Tomlins等，2011；Tomlins等，2016）。随着现在在各种疾病部位都可获得数千个ncRNA的表达数据，识别新的单一生物标志物（如表2所示）或生物标志物组合的潜力是无限的。以下四个具有强有力的科学性且是数百个围绕ncRNA相关生物标志物的临床试验的例证性例子。

"将microRNA血液检测加入低剂量CT肺癌筛查"（NCT03452514）一个由Hummingbird Diagnostics赞助并在哈佛医学院和Lahey Clinic进行的试验目前正在招募中，以确定miRNA谱（Hummingbird专有的HMBDx）是否优于低剂量计算机断层扫描（LDCT）对于肺癌的诊断的特异性。目标招募对象为符合肺癌筛查标准的400名参与者。在此试验中，将使用血液采样来筛查血清miRNA特征（Keller等，2011a；Keller等，2011b；Leidinger等，2012），在低剂量CT之前进行，并与随访至少12个月后的未来结果进行相关性比较。尽管CT检测肺结节的能力很高，但却存在假阳性和反复暴露于辐射的问题。能够使用简单的非侵入性基于血液的miRNA检测将是肺癌诊断的重要进展。

评估在胶质瘤患者中MicroRNA-10b的表达水平（NCT01849952）胶质母细胞瘤是最具侵袭性的癌症之一，急需开发新的早期生物标志物和治疗靶点。如上所述，致瘤性miR-10b在胶质母细胞瘤中高度表达且对肿瘤生长至关重要（El Fatimy et al., 2017）。这项多中心临床试验由Dartmouth-Hitchcock医疗中心、Tufts医学中心、马萨诸塞州综合医院和佛蒙特大学赞助和进行。该试验将测试胶质母细胞瘤患者原发肿瘤、血液和脑脊液样本中miR-10b表达水平是否可以作为胶质母细胞瘤的预后和诊断标志物。将miR-10b的表达水平与参与这项研究的预期200名脑胶质瘤患者的存活率、肿瘤分级和基因型变异进行相关分析。

"DICER1相关胸腔肺泡母细胞瘤癌易感综合征：一项自然病史研究"（NCT01247597）这项旨在招募1,500名参与者的大型观察性研究由国家癌症研究所（NCI）赞助。如上所述，DICER1是一个参与miRNA生物合成途径的核糖核酸酶（Hill et al., 2009）。该试验旨在确定DICER1遗传突变所导致的特定癌症和良性肿瘤的类型，特别是胸腔肺泡母细胞瘤（PPB），这是一种在幼儿中出现的罕见肺瘤。研究人员正在收集有PPB或与PPB相关的其他罕见肿瘤（如囊性肾瘤、鼻腔软骨间叶错构瘤、卵巢Sertoli-Leydig细胞瘤、眼睫状上皮瘤）的个体及其近亲的进一步医学史和遗传信息，以便更好地了解这种疾病。

"上皮性卵巢癌外泌体中的非编码RNA"（NCT03738319）这项由北京协和医院赞助的病例对照观察性研究将使用下一代测序技术分析160例高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）患者以及良性妇科疾病患者的血液样本中miRNA和lncRNA的表达。将比较癌症组和对照组中miRNA和lncRNA的差异表达，并验证候选的非编码RNA作为卵巢癌的检测和预后生物标志物。该试验的完成有望带来有希望的临床非编码RNA生物标志物，可用于帮助早期发现该疾病，该疾病通常在晚期才能得到诊断（Giannopoulou et al., 2019）。

Therapeutic Targeting of ncRNAs in Cancer Clinical Trials

在本综述中讨论了，ncRNAs 是重要的调控分子，可以推动或阻止致癌过程（图1和2；表1）。因此，近年来，开发有效的治疗方法来抑制（对于致癌基因）或过度表达（对于肿瘤抑制基因）ncRNAs，一直是一个活跃的研究领域（Adams等，2017年；Arun等，2018年；Rupaimoole和Slack，2017年）。在体内抑制ncRNAs通常需要通过寡核苷酸靶向ncRNA以及递送方法来实现。对于miRNA的靶向，采用含有miRNA二聚体结构的合成寡核苷酸（miRNA mimetics）（miRNA过度表达时）。相反，对于抑制致癌miRNA，采用单链反义RNA（antimiRs或antagomiRs）（Rupaimoole和Slack，2017年）。通常对RNA药物进行化学修饰以增加体内稳定性和亲和性。常见的例子包括锁定核酸（LNA）修饰，用于锁定RNA的糖磷酸骨架的构型，并对核糖糖的2'-OH做取代修饰，如2'-O-甲基（2'-O-Me）或2'-O-甲氧乙基（2'-O-MOE）修饰（Adams等，2017年）。除了优化靶向设计外，RNA药物在体内通常需要一个递送方法，脂质基纳米载体是最成熟的方法，同时还有肽和聚合物递送系统的新进展（Adams等，2017年；Rupaimoole和Slack，2017年）。lncRNAs可以通过反义寡核苷酸（ASO）技术在体内进行抑制，从而导致目标lncRNA的 RNase H 依赖性降解（Arun等，2018年）。还可以对lncRNA靶向的ASO进行特定的化学修饰以增加稳定性，如上述的LNA、2'-O-Me或2'-O-MOE，S限制的乙基（cEt）修饰，或''GapmeR'' RNA-DNA-RNA 混合 ASOs。该优化甚至实现了下一代具有更高效力的ASOs的开发，这些ASOs可以在体内自由摄取，不需要递送方法（Hong等，2015年；Yamamoto等，2015年）。迄今为止，在癌症领域使用ncRNA靶向药物的大多数研究都处于临床前阶段，但这些研究无疑展示了这种策略的前景。例如，基于ASO的去除lncRNA MALAT1可以影响小鼠模型中肺癌和乳腺癌细胞的生长和转移（Arun等，2016年；Gutschner等，2013年）。下面，我们将详细介绍已经完成的两个治疗性临床试验以及报道了初步结果的一个试验，这些试验均针对miRNAs。由于尚未完成直接靶向其他类别ncRNAs的治疗性试验，因此讨论了在膀胱癌临床试验中利用H19 lncRNA启动子的一种替代策略。随着研究和技术的进步，相信会有更多基于ncRNA的治疗方法进入临床。

''MRX34微核糖核酸（miR-RX34）脂质体注射液的多中心第一阶段研究''（NCT01829971/ NCT02862145）。这项国际研究由Mirna Therapeutics（现Synlogic Therapeutics）赞助，在美国和韩国的多个实验室进行。该研究评估了MRX34在无法手术切除的原发性肝癌、选择性晚期或转移性癌症（无论是否涉及肝脏）以及血液恶性肿瘤患者中的安全性。该药物是一种通过静脉注射给予的脂质体miR-34模拟物。正如上文所述，miR-34是一种抑制肿瘤的miRNA，它是p53的直接靶标，并调节了几个癌基因的表达（Adams et al.， 2016a；Kasinski和Slack，2012；Liu等，2011）。共有47名患者接受了该药物治疗，确定了最大耐受剂量（MTD），而其中一些患者也出现了部分缓解（Beg等，2017）。从这项研究中，作者得出结论认为MRX34显示了一定的抗肿瘤活性，并且是安全的。然而，一项1b期临床试验表明，多名患者出现了免疫相关毒性反应，其中一些患者出现了严重的（4级）细胞因子释放综合征，因此该试验被终止。由于尚未公布试验的最终结果，目前尚不清楚为什么这些患者出现严重不良事件（SAEs），但值得注意的是，脂质基纳米粒和小双链RNA都有可能引起免疫毒性反应（在Levin，2019中有讨论）。

另一项临床试验（NCT02716012）则使用了相同的脂质纳米颗粒（称为Smarticle），但结合了目标为编码CEBPA蛋白的不同双链RNA（dsRNA）（由Asbestos Diseases Research Foundation和EnGeneIC Limited赞助，在悉尼大学进行）。该研究评估了TargomiRs在复发性恶性胸膜间皮瘤（MPM）和非小细胞肺癌（NSCLC）患者中的最大耐受剂量（MTD）。静脉注射的TargomiR药物是一种包含23个碱基对的双链合成miR-16模拟物的微型细胞（Reid等，2013）（图2A）。药物输送载体由非活体细菌微型细胞构建，外表覆有靶向物质，即抗EGFR抗体。这可以将颗粒及其miRNA荷载特异性定位于EGFR表达的癌细胞上。共有26名患者接受了TargomiRs治疗，并确定了MTD（van Zandwijk等，2017）。其中一名患者对治疗显示了部分缓解，研究者得出结论，他们的研究支持进一步的试验，也许可以与其他目前的治疗方法联合应用。

《ncRNA在癌症临床试验中的治疗靶点》章节的翻译如下:

''MRG-106在蕈样肿瘤（MF）、CLL、DLBCL（弥漫性大B细胞性淋巴瘤）或ATLL（成人T细胞白血病/淋巴瘤）患者中的安全性、耐受性和药代动力学研究''（NCT02580552/NCT03713320）。这些由miRagen Therapeutics赞助，在美国和加拿大的多个地点进行的研究旨在评估cobomarsen（又称MRG-106）在诊断为某些淋巴瘤和白血病亚型的患者中的安全性和潜在疗效。Cobomarsen是一种LNA，设计用于抑制miR-155的活性（图1A），miR-155是这些癌症中水平较高的致癌性miRNA，对MF癌细胞的生长和存活至关重要（Seto et al.，2018）。在2018年美国血液学会会议上的初步结果表明，cobomarsen在43名接受肿瘤内或全身治疗的患者中耐受性良好。此外，一些患者出现了持久的部分缓解。

''对不对Bacillus Calmette-Guerin（BCG）治疗不响应的NMIBC进行Inodiftagene Vixteplasmid（BC-819）的研究''（NCT03719300）。H19是一种lncRNA，在不同类型的癌症中通常上调，具有多种致癌机制（Bhan et al., 2017）。由于其在癌细胞中的上调表达，研究人员利用其启动子来传递下游序列的癌细胞特异性表达。一种名为BC-819（也称为DTA-H19）的化合物是一个DNA质粒，其在H19启动子的调控下表达白喉毒素A（DTA），并与聚乙烯亚胺（PEI）形成复合物。BC-819在胰腺癌、卵巢癌和膀胱癌中已完成1/2a期试验，目前的临床开发重点是膀胱癌，因为H19在正常细胞中常常受抑制，但在肿瘤细胞中上调（Gofrit et al., 2014）。此多中心试验由Anchiano Therapeutics赞助，将研究140名对Bacillus Calmette-Guerin（BCG）治疗不响应的NMIBC（非肌层侵袭性膀胱癌）患者。BC-819将直接滴入膀胱，并将在整个研究过程中评估临床疗效的多个指标。尽管不直接针对ncRNA，但这是一个有趣的例子，展示了ncRNA的特性（如H19癌细胞特异性表达）如何被应用于新型的癌症治疗干预措施。

Perspectives and Future Opportunities

展望未来，非编码RNAs（ncRNAs）有望继续协助研究人员和临床医生发现分子特征，从而更精细地诊断和区分恶性与良性组织，以及不同类型的癌症。这些检测也可能被用于确定预后，例如确定转移风险或对化疗等治疗方法的响应概率。虽然治疗应用仍处于早期阶段，但预计基于参与癌症途径的ncRNAs的药物将有一天被用于癌症患者的处方。对于识别候选生物标志物或治疗靶点，将重点放在特定于细胞系谱或疾病的ncRNAs上似乎是理想的方法，就像前面在前列腺癌中提到的PCA3（Hessels et al., 2003）一样。表达水平也是开发基于ncRNAs的诊断和治疗方法的关键因素。正如前面所提到的，与蛋白质编码基因相比，长链非编码RNAs（lncRNAs）的表达水平通常较低（Derrien et al., 2012;Iyer et al., 2015），因此识别那些可以被方便检测到的候选物至关重要。此外，发现尿液或血液中的诊断性生物标志物对于避免与组织采集常见相关的非侵入性程序对患者来说是理想的。
与生物制剂或小分子相比，RNA-based治疗具有重要的优势和挑战，应该予以考虑。RNA药物基于核苷酸杂交，因此可以轻松靠近目标；只需要确定序列并测试候选药物的活性。而对于小分子或生物制剂，需要使用更长且费力的筛选或基于结构设计的方法。还有可能设计基于RNA的方法，可以轻松靶向多种RNA的组合。尽管具有这些优势，但RNA药物的递送方法必须考虑和优化，这往往是一个具有挑战性的过程。与小分子和生物制剂相比，RNA-based药物的口服制剂更加困难。正如上面所提到的，RNA-based药物还存在免疫相关毒性和其他不良事件的问题。改进寡核苷酸化学和递送方法的工作在不断进行，以减轻未来研究中出现的这些问题。最后，克重量小分子的成本要比RNA-based药物低得多。阅读者可以参考最近的优秀综述（以及其中的引用）来了解以上两段话的更多讨论（Adams等，2017;Levin, 2019;Rupaimoole and Slack, 2017;Setten等，2019）。
我们团队的成员最近通过使用来自癌症患者肿瘤的患者衍生的器官样本（PDO）和异种移植（PDX）展示了靶向在个体癌症患者肿瘤中上调表达的oncomiRs的潜力（Gilles等，2018），为个性化RNA药物开启了令人兴奋的可能性。目前，每个癌症患者都被分配到一个专门的护理团队，包括专业的肿瘤外科医生、肿瘤医学家、放射肿瘤学家和病理学家。可以设想，肿瘤委员会将在每个癌症患者的标准护理中添加一个整合的ncRNA工作流程。这可能包括以下组成部分：在癌症患者的肿瘤和血清上进行完整的RNA-seq（包括ncRNAs）；对肿瘤和生殖细胞基因组进行完整的全基因组测序；整合的生物信息学和病理学分析，以量化患者癌症中的恶性病理表型，以及确定显著变化的基因组和ncRNA变化；病理学报告包括对肿瘤病理学、DNA和RNA数据以及潜在的治疗易感性的解释，这将在肿瘤委员会上呈现以帮助治疗决策；在PDO和PDX上生长并测试疗法的建议（例如传统药物测试和以RNA谱为重点的ncRNA-based药物筛选）；可能的ncRNA-based疗法的建议；将患者的DNA / RNA和预后数据的可搜索文件放置在患者的电子病历中，以便将来重新分析，如果有必要，并且如果有其他ncRNA信息变得已知。ncRNAs的发现开启了医学史上的新篇章，承诺彻底改变癌症和其他疾病（在Adams等，2017;Levin, 2019;Rupaimoole和Slack, 2017中有讨论）的诊断和治疗方式，而我们仅仅是刚刚开始。

SUPPLEMENTAL INFORMATION

《补充信息》可在以下网址在线获取：https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.017。