随着单细胞测序技术的发展，各种多组学技术都被逐渐引入到这一大家庭中来。上一期我们给大家介绍了单细胞转录组+表面蛋白测序技术，本期我们将聚焦另一种多组学技术——单细胞转录组+染色质可及性测序。
染色质可及性(Chromatin accessibility)是指核大分子能够与染色质化的DNA进行物理接触的程度，由核小体及其他阻碍接近DNA的染色质结合因子的占据和拓扑结构所决定。这恰好属于近年来一大研究热点——表观遗传学的范畴。表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化的一门遗传学分支学科，其中很重要的一种就是染色质的构象变化引起的基因表达调控。随着该领域进展，与表观遗传调控相关的研究迅速增长。表观遗传调控已成为研究很多生物学现象及其背后机制必不可少的一环。
接下来，本文将从技术概况、核心原理&实验流程、数据分析策略、应用领域及案例、样本准备及运输注意事项等方面，为您详细介绍和解析这种单细胞转录组+染色质可及性测序多组学技术。
技术概况
什么是scATAC-seq + scRNA-seq多组学技术？
真核生物的染色体由组蛋白和DNA组成，由DNA进一步缠绕形成高度螺旋的凝缩结构。而这种高度螺旋的凝缩构象变化又可以通过表观遗传在染色质水平上进行调控，例如组蛋白的乙酰化导致的染色质局部的松弛而让RNA聚合酶II能顺利结合进行转录、DNA的甲基化导致原本呈松弛的DNA构象变得浓缩，使染色质形成一个“紧密”的结构，让目的基因的转录无法有效进行。因此，染色质在结构上的“开放”程度就代表了其可及性的高低。
2013年，来自斯坦福大学的William Greenleaf教授在Nature Methods发表题目“Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position”的论文，提出一种能够检测染色质可及性的技术——ATAC-seq，全称为“Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing”，即基于高通量测序对染色质可及性进行检测。
2018年底，10x Genomics公司推出了商业化的scATAC-seq技术产品，在ATAC-seq的基础上加入单细胞分离步骤，实现了单细胞水平上的染色质可及性检测，进一步促进了ATAC-seq在科研领域的发展和应用。
目前，该技术的最新版本已实现了染色质可及性与转录组的共同检测，提供一种能够将单细胞表观信息与转录组信息联合起来的方法，从而允许研究者在单细胞水平揭示细胞核内染色质可及性差异、鉴定细胞类型特异的转录因子、深入研究转录调控网络和预测转录因子结合位点，推测染色质调控活性等。
核心原理&实验流程
scATAC-seq + scRNA-seq是如何在单细胞维度上联合表观与转录组信息的？
在10x Genomics的scATAC-seq + scRNA-seq的多组学技术中，之所以能够实现我们对同一细胞核的染色质可及性与转录本进行同时分析的目的，其优势是在于Tn5转座酶的特性，以获取“开放”的染色质DNA片段，以及10x Genomics的微流控平台，以实现单细胞的区分与标记。基于这两大核心原理，再进行进一步的测序与分析，我们就能够获得针对同一细胞的表观组与转录组信息，对单细胞染色质构象的变化、单细胞的选择表达性进行深层次的探究。
该技术的基本实验流程包括：单细胞悬液制备，转座酶切割，细胞加条码与文库构建，高通量测序以及数据分析及可视化。具体过程为：首先将样本（组织或细胞）进行细胞核提取，得到背景干净和结构完整的单细胞核悬浮液后加入Tn5转座酶对染色质开放区域进行剪切以获得片段化的DNA，同时在DNA片段的末端添加测序引物；其次将带有条码的凝胶珠和单个细胞包裹在油滴中形成GEMs，凝胶珠在油滴内溶解后能够与细胞核裂解释放的DNA+RNA结合完成单细胞标记。凝胶珠中分别具有两种接头序列用，其一可利用Ploy（dT）来捕获细胞中的mRNA，UMI用作区分同一细胞中不同的mRNA，10x Barcode用作区分不同的单细胞，read 1用作后续的测序；其二在于连接从染色质中释放出来的DNA片段，并且同样基于10x Barcode来区分不同单细胞的DNA片段以及后续的DNA文库扩增接头序列。在凝胶珠中完成DNA与mRNA的标记后，即可通过PCR扩增等方法完成转录组+ ATAC文库的构建。总的来说，两种关键的接头序列最终实现了对同一细胞中DNA和RNA的捕获。
数据分析策略
如何对scATAC-seq与scRNA-seq多组学技术数据进行分析？
scATAC-seq与scRNA-seq多组学技术产生的数据包含两类，即ATAC数据和转录组数据。对于单细胞转录组数据，百奥智汇可提供多种规格的深度分析服务，详情可见公号相关文章。对于ATAC数据，百奥智汇能够根据基因启动子的区间开放程度，将单细胞染色体开放区域数据转换成标准化的类单细胞表达矩阵，然后用标准化矩阵进行聚类与降维，生成基于ATAC数据的可视化结果（t-SNE、UMAP等多种算法），并根据该结果进行细胞类型注释。同时，我们还能够比较细胞类型之间的差异富集区域，揭示细胞类型特异开放的转录因子结合区域。除了对两种数据的单独分析外，百奥智汇还支持对两种数据的整合分析，例如基于基因表达数据获得的分群注释结果，解析特异性细胞类群特定基因的染色质开放性情况，并与对应的基因表达数据进行联合解读。
应用领域
肿瘤免疫调控与发育生物学等领域
应用实例：
肿瘤微环境的调控网络探究
如前文所介绍，scATAC-seq与scRNA-seq多组学联用，可以将细胞的染色质水平信息与基因表达信息结合起来，实现表观遗传调控的分析与探究。2019年，来自斯坦福大学药学院的William J. Greenleaf教授团队就基于scATAC-seq与scRNA-seq多组学的应用，在Nature Biotechnology上发表了以“Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion”为题的研究性论文。
在该研究中，作者通过系统地对两种不同生物学背景下的原代细胞进行了scATAC-seq来对基底细胞癌（BCC）肿瘤微环境中的调控网络进行了表观遗传学的探究。在该研究中，作者首先绘制了健康人的骨髓和血液样本中血液形成的单细胞染色质及可及性分布图，揭示了祖细胞的染色质状态及其分化为效应细胞类型的调控轨迹。其次，作者对在接受了PD-1阻断剂的基底细胞癌患者的原发性肿瘤活检中进行了scATAC-seq，探索了治疗响应的T细胞亚群的染色质调控因子，以及控制肿瘤内CD8+ T细胞耗竭和CD4+ T滤泡辅助细胞发育的调控程序。
总之，该研究利用10x Genomics的scATAC-seq技术对人体血液细胞和基底细胞癌进行了分析，发现该技术可以识别细胞类型特异性的顺式和反式调节元件，刻画疾病相关增强子活性，重构从祖细胞开始的分化轨迹。在基底细胞癌中揭示了肿瘤微环境中恶性细胞、基质细胞和免疫细胞的调控网络，并揭示了T细胞耗竭机制。此外，作者还通过对PD-1单抗阻断前后一系列肿瘤组织的分析，揭示了控制肿瘤内CD8+ T细胞耗竭和CD4+ T滤泡辅助细胞的调控程序，从而对PD-1阻断治疗基底细胞癌无效的机制提供了解释。
样本准备及运输注意事项
如何准备一个合格的scATAC-seq + scRNA-seq的多组学检测样本？
目前，百奥智汇可承接基于10x Genomics的scATAC-seq + scRNA-seq的多组学检测分析项目，支持多种类型的组织，包括组织样本、血液样本和细胞样本。良好的样本准备流程及运输过程对该实验的成功至关重要，因此我们总结了一些样本准备流程和运输注意事项，希望能够对大家的课题研究提供帮助。
组织、血液及细胞等新鲜样品的样品准备
✦新鲜组织：取至少250 mm3体积的样品量，使用1640培养基、PBS缓冲液或生理盐水清洗2-3遍（客户也可以根据自己组织的情况，选择适宜培养基清洗；对于肿瘤等不易沾染血液的组织也可以不清洗）。在30分钟内完成对样品的初步处理后，置于5 mL的组织保存液（美天旎），组织需要完全浸没于组织保存液中。保存液需提前置于4℃中预冷。
✦新鲜血液：取至少3mL体积的样品量，迅速置于EDTA抗凝管中4℃保存。
✦消化细胞悬液、细胞系：取至少5×105个细胞（可根据细胞浓度计算），取后置于已提前4℃预冷含10%血清的PBS缓冲液中，4℃保存。
样品寄送
冰上（保持低温运输 4℃-16℃）快递至百奥智汇。
参考文献：
Buenrostro J D, Giresi P G, Zaba L C, et al. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position[J]. Nature methods, 2013, 10(12): 1213-1218.
Satpathy A T, Granja J M, Yost K E, et al. Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion[J]. Nature biotechnology, 2019, 37(8): 925-936.
Llorens-Bobadilla E, et al. A latent lineage potential in resident neural stem cells enables spinal cord repair. Science. 2020 Oct 2;370(6512):eabb8795.
