need:表达矩阵 分组矩阵，值要是整数
DESeq2和EdgeR都可用于做基因差异表达分析，主要也是用于RNA-Seq数据，同样也可以处理类似的ChIP-Seq,shRNA以及质谱数据。
这两个都属于R包，其相同点在于都是对count data数据进行处理，都是基于负二项分布模型。因此会发现，用两者处理同一组数据，最后在相同阈值下筛选出的大部分基因都是一样的，但是有一部分不同应该是由于其估计离散度的不同方法所导致的。
library(DESeq2)
library(limma)
library(pasilla)#示例数据包
data(pasillaGenes)
exprSet=counts(pasillaGenes) ##做好表达矩阵
group_list=pasillaGenes$condition##做好分组因子即可
(colData <- data.frame(row.names=colnames(exprSet), group_list=group_list))
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,
colData = colData,#Rows of colData correspond to columns of countData
design = ~ group_list)
##上面是第一步第一步，构建dds这个对象，需要一个表达矩阵和分组矩阵！！！
dds2 <- DESeq(dds) ##第二步，直接用DESeq函数即可
resultsNames(dds2)#results extracts a result table from a DESeq analysis giving base means across samples, log2 fold changes, standard errors, test statistics, p-values and adjusted p-values; resultsNames returns the names of the estimated effects (coefficents) of the model; removeResults returns a DESeqDataSet object with results columns removed.
res <- results(dds2, contrast=c("group_list","treated","untreated"))#this argument specifies what comparison to extract from the object to build a results table
## 提取你想要的差异分析结果，我们这里是treated组对untreated组进行比较
resOrdered <- res[order(res$padj),]#padj排序
resOrdered=as.data.frame(resOrdered)
可以看到程序非常好用！
它只对RNA-seq的基因的reads的counts数进行分析，请不要用RPKM等经过了normlization的表达矩阵来分析。
值得一提的是DESeq2软件独有的normlization方法！
rld <- rlogTransformation(dds2) ## 得到经过DESeq2软件normlization的表达矩阵！
exprSet_new=assay(rld)
par(cex = 0.7)#指定符号的大小
n.sample=ncol(exprSet)#样本数
if(n.sample>40) par(cex = 0.5)
cols <- rainbow(n.sample*1.2)
par(mfrow=c(2,2))
boxplot(exprSet, col = cols,main="expression value",las=2)
boxplot(exprSet_new, col = cols,main="expression value",las=2)
hist(exprSet)
hist(exprSet_new)
第一张图也是箱型图
看这个图就知道了，它把本来应该是数据离散程度非常大的RNA-seq的基因的reads的counts矩阵经过normlization后变成了类似于芯片表达数据的表达矩阵，然后其实可以直接用T检验来找差异基因了！
但是，如果你的分组不只是两个，就复杂了，你需要再仔细研读说明书，甚至你可能需要咨询实验设计人员或者统计人员！
