方法
- 从文献中获取+NCBI Primer Blast（用的少，需要找到靠谱的文献，其次还要平时积累才行，主要适用于特定生物学过程maker gene panel的RT-qPCR验证，eg：纤维化、炎症等）
- NCBI gene+Primerbank+NCBI Primer Blast（最方便的方法，且很多引物都有validation溶解曲线的结果，靠谱~，但貌似只有mRNA的，没有lncRNA的；即使靠谱，仍然需要blast验证！本人已经发现几个网站设计的引物特异性不好的例子）
- NCBI gene+Primer3plus自主设计+NCBI Primer Blast
- 直接用NCBI Pick primer设计引物（B站视频）（其实也是用的Primer3）
一个好的qPCR引物对，设计时需要具备什么特性？(B站视频)
手把手教你设计RT-PCR引物，以及引物设计时的注意事项（B站视频）
一定要blast检查引物特异性！尤其是自己设计的，有些引物的特异性不好。
NCBI:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
NCBI Primer Blast: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
Primerbank: https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
Primer3Plus: https://www.primer3plus.com/
方法2
先在NCBI gene里检索基因名得到ncbi gene ID，再到Primerbank内检索引物，注意区分人和小鼠，优先选择有验证结果的引物（绿色高亮）。
方法3
先在NCBI gene里检索基因名，选择目标物种点开，下拉找到NM_（mRNA）或NR_（lncRNA）开头的链接，进去后点击CDS（mRNA）（lncRNA这里好像就不适用了），复制碱基序列，粘贴至Primer3Plus，修改引物长度18-25bp，GC% 40%-60%，product size改为80-150bp，其余不修改，点击“pick primers”，得到结果后进行blast验证。
方法4
先在NCBI gene里检索基因名，选择目标物种点开，下拉找到以NM_（mRNA）或NR_（lncRNA）开头命名处，点击这串accession号，进去后右侧栏内点击“Pick primers”，跳转至Primer blast界面，依次修改：product size（70-200 bp），退火温度（59-62-65℃），Database（mRNA选Refseq mRNA；lncRNA选Refseq RNA），是否跨外显子或内含子（两者意义不同，跨外显子是指一条引物会横跨两个相邻外显子的连接处，而跨内含子是指product片段跨区），Advanced参数里修改引物长度18-25，GC% 40%-60%。检查物种是否正确（一般点pick primer进来，系统会自动补充正确的物种，因为在选择gene那一块已经选择过物种了，只有在对已有引物进行blast的时候需要自己选择物种，此时需注意核对。）。
基本原则
- 引物长度 18-25bp
- GC% 50-60%
- 退火温度 60℃左右（59-65，62度最佳）
- 产物长度 80-150bp（70-200bp，150最佳）
- Database（mRNA选Refseq mRNA；lncRNA选Refseq RNA）
如何知道自己设计或得到的引物是否跨外显子？Blast可以看图得知（需要同时输入引物对序列和参考模板序列，即对应RNA的accession号）
用Primer Blast设计lncRNA的时候如何选择跨外显子？貌似不行啊
解决方案1：自己根据外显子位置，限定引物区域。（Range不可填“0”，可以填“1”）
待解决的疑问
Blast时如何判断是否特异？（有时候会出现blast到其他基因的情况，但product size较大，多大bp就基本可以认为P不出来或者效率很低以至于可以忽略不计？how about 795bp？）
对于mRNA而言，如果设计的引物不全是在CDS区会有影响吗（即product片段只有部分以CDS为模板）？是否一定要CDS区？
