你设计的引物是否有用？在做实验之前可以做一个电子PCR
qPCR引物设计+在线验证
方法一：NCBI上-probe
1.之前NCBI上有一个probe选项可以直接设计引物，上面会给出上下游序列。比如搜索小鼠nanog基因，它给出了这样的两条引物：
上游引物：TTGCTTACAAGGGTCTGCTACT
下游引物：ACTGGTAGAAGAATCAGGGCT
方法二：Primer3web
参考：Primer3web在线引物设计--2分钟学会步骤极简的引物设计！ - 哔哩哔哩 (bilibili.com)
2.1. 寻找基因序列
以human p53为例进行引物设计。
PubMed官网：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
第一步：下拉条目选择核苷酸（Nucleotide）
第二步：输入基因+物种+mRNA（例如：p53 human mRNA）
第三步：点击搜索（Search）
第四步：单击选择 左边栏的（mRNA4.782）
第五步：单击进入第一条（Homo sapiens mRNA for P53, complete cds）为我们所寻找的p53 human mRNA
第六步：单击选择Features中的CDS 选项
第七步：单击选择FASTA 格式就会出现这个 基因的CDS系列
2.2.开始设计引物
Primer3web官网：http://primer3.ut.ee/
进入Primer3web官网后，执行以下操作：
第一步：下拉条目选择物种（HUMAN）
第二步：在输入框中输入刚刚复制来的CDS序列
第三步：单击获取引物（Pick Primers）
第四步：引物序列输出；在最终结果中，有四对引物供选择。
选择合适的引物：怎样算合适？
首先看看引物的就是扩增长度，100~300bp 间比较好扩增；
引物长度在 20~25bp 较好，而且上下游引物间不要相差超过 5bp；
再就是看看 Tm 值，60℃左右，相差不要超过 1℃。
再加一点：
既然是设计qPCR引物，那么一定要跨外显子设计，这样可以避免基因组DNA的影响CT值，如果没有跨越外显子，则扩增出来的溶解曲线CT值就会偏小。那么怎样知道自己设计出来的引物有没有跨外显子设计呢？
答案是可以根据自己设计的引物所在的基因组位置去和NCBI上该基因的外显子和内含子的连接位置进行对比。直接看那个基因的mRNA的join位置即可。
方法三：NCBI-BLAST-primer-blast
以上引物设计完成后还要自己手动去查找引物是否跨越了内含子，太麻烦了。那么再普及更方便的办法。
参考：https://www.biomart.cn/experiment/430/457/460/2282619.htm
3.1:在NCBI上找到目的基因的mRNA序列
打开NCBI主页面，选GENE，输入基因名称-》显示出很多不同种但名字相同的基因-》找到你要的种属，打开-》显示基因信息，找到“mRNA and protein”前面那个NM***********,号码复制下来。
注意：这个时候会看到有很多条NM****信息，表示这个基因不同的isoform,通过查找文献以及这些基因序列后面的解释来确定。如果不清楚，一般选择最长的那条。
3.2:开始设计跨越外显子的引物
打开NCBI上-BLAST-primer-blast网站，将上面复制的mRNA编号输入序列框中，下拉选项中选择你的物种，然后在Exon junction span下拉框选择Primer must span an exon-exon junction，设置引物长度最小和最大值，然后点击Get primer。就可以跳到Primer-BLAST Results页面。这个过程会有点长，稍微等一下。出来后，里面有个Graphical view of primer pairs那一栏，会告诉设计出来的几对引物分别跨越了哪几个外显子。
在这些跨越外显子的引物对中选择最好的那对：
a).一对引物中只要有一个引物跨越了外显子就可以了。（因为一个引物跨了内含子，这条引物就不会和基因组DNA匹配，就算另外一个引物和基因组DNA匹配了，一条引物是扩不出来东西的。因为一条引物扩增达不到指数增长，扩了几十个循环后，信号就被指数增长的正确匹配的信号给掩盖了。就像在普通PCR中，只加上游或者下游引物，PCR出来绝对是没有东西的。因为产量太低了。）
b). 一对引物之间的距离不要太长，因为扩增产物要求在100-300bp之间比较好，过长会影响CT值变小。
验证自己设计的引物PCR出来什么东西呢？可以做一个电子PCR看看。
1.UCSC-Tools-In-Silico PCR
进入UCSC,选择Tools的In-Silico PCR,输入上下游引物，target选择genome assembly,点击submit，或者如果这样出不来，记得勾选Flip Reverse Primer。因为可能上下游弄反了。提交后顺利的话，会出来一大段序列，上面会告诉你这个电子PCR做完后产出的序列在染色体上的位置及起止长度.然后再NCBI的gene选项输入自己PCR的目的基因，看看目的基因的起始位置，就知道这个PCR出来的是不是目的基因序列了。
注意：OCR产出的序列只可能是目的基因的一部分，对比一下序列起始位置就知道了。因为设计引物时是用目的基因设计的，PCR出来的是两条引物之间的序列。
- NCBI-BLAST-primerBLAST
参考：学会这个方法，5 分钟找到合适的 qPCR 引物 - 实验方法 - 丁香通 (biomart.cn)
进入NCBI-BLAST-primerBLAST;或者直接进入这个网址：Primer designing tool (nih.gov)
在primer parameter输入你刚刚设计的上下游引物
在database下拉选项选择Refseq mRNA
再点击Get primer；
等一会，会卡一会 才出来。
出来了一个Detailed primer reports;上面写了Products on target template都是Homo sapiens tumor protein p53 (TP53)的不同转录本，且出来的产物长度也一样。说明这对引物扩增出来的就是这个基因。
两种验证方法优缺点：
UCSC验证方法可以检验你扩增出来的所有序列；
而NCBI的BLAST只能给出扩增出来的东西是不是你要的基因，以及扩增出来的产物的长度。
选择：建议使用NCBI-BLAST-primer-blast方法设计引物，也用NCBI-BLAST-primer-blast方法验证你设计出来的引物。
【技术分享】qPCR引物设计有妙招 - 知乎 (zhihu.com)
例如：Syt4（mouse）这个基因设计qPCR引物
step1:进入NCBI-GENE,找到这个基因的mRNA的NM*****号
step2:将这个号输入NCBI-BLAST-primer-blast输入序列框中，勾选相应条件;，且限制了PCR产物长度在70-300之间；由此设计出了10条跨内含子的引物,由Tm条件等选出了第二对引物：
上游： GTGTCTGGACTTTCAGATCCCT
下游： CCAACCGTCCAATCACCTCA
step3:将这对引物重新输入NCBI-BLAST-primer-blast的上下游引物框中，点击Get primers,发现这对引物扩增出来的基因就只有Syt4基因，说明这对引物特异性很好。
step4：进入UCSC-Tools--In-Silico PCR,输入上下游引物，点击提交，即可。如果跳转出来没有产物，则重新返回调整一下参数，比如说target参数，Flip Reverse Primer:是否勾选等。最终产物是Syt4，长度220bp。说明这对引物的PCR产物特异性很高，只有这一个产物。
step5：进一步验证：由于设计引物时跨越了内含子，且已经提醒我是上游引物跨越了内含子，于是我进入NCBI-Nucleotide 输入：Syt4 Mus musculus mRNA,点击搜索，然后点击左边栏目中的mRNA,然后点击第一条........参考以上2.1步骤，寻找这个基因的CDS序列，找到CDS序列后，搜索这两条上下游引物，发现在CDS区域中，且这对引物的PCR产物序列也在CDS区域中，仔细查看发现上游引物所在位置是1203-1224，确实跨越了两个外显子：exon 1098..1218和 exon 1219..3901.
以上我们设计出了Syt4这个基因的qPCR引物序列。可以直接让公司合成了。
-
另外可以用一个更简单的方法，还是用NCBI数据库
例如，cst6这个基因
NCBI-Nucleotide 输入cst6 mRNA,出来的上面的第一条就是。点入翻到最后。在mRNA和Protein一栏选择第一条NM_028623.5点入(如果你的基因不是ncRNA,则这里不会有mRNA和protein这栏，取而代之的是Genomic那栏，以NG开头的RNA序列号，点击genebank后则显示该基因的具体信息)。
image.png
image.png
点入后跳到了以下这个页面。点击右边的pick primers
image.png
然后跳到了以下设计引物的页面,这个时候页面自动输入刚刚的NM_028623.5，选择pcr产物的长度100-150，是否跨外显子(primer must span an exon-exon junction)，基因组选择鼠基因组。提交就可以了。
image.png
提交后会返回很多引物，把这些引物输入NCBI-primer blast,看PCR出来的结构是否具有特异性。
image.png
-
或者用primerbank直接搜别人用过的引物
image.png
绿色的表示别人验证过的
image.png
挑选出绿色的primer，拿到NCBI primer blast里面进行验证
image.png
提交get primers,查看结果是否只有目的基因这一个结果。如果目的基因多个变体，可以接受。如果有多个基因，表示这对引物会不够特异。
以上所讲的都是qPCR的引物设计，一般扩增出来的基因产物都只有100-300bp之间，用于定量或者半定量。但是如果想要扩增全长DNA，则用到Primer5软件。扩增产物的长度可以自己在上面设置。
如何使用Primer Premier 5软件设计PCR引物-百度经验 (baidu.com)
