Science | 改造皮肤细菌诱导抗黑色素瘤的T细胞反应

原创 傅坤元 图灵基因 2023-04-18 10:11 发表于江苏

撰文：傅坤元

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亮点：

一种细胞壁表达卵清蛋白的表皮葡萄球菌诱导T细胞能够限制黑色素瘤生长，作用温和，不会引起免疫副作用；联合免疫检查点抑制剂后，能够减少淋巴细胞耗竭，提升抗肿瘤能力。

2023年4月13日，通讯作者为美国斯坦福大学的Michael Fischbach教授在《Science》发表了题为“Engineered skin bacteria induce antitumor T cell responses against melanoma”的文章。

某些皮肤共生菌种能够引起强烈的T细胞反应，具有3个明确特征。第一，诱导产生的T细胞亚型由细菌及其微环境决定。例如，某些表皮葡萄球菌诱导CD8+ T细胞。第二，细菌诱导的T细胞表达出特异性的T细胞受体。第三，T细胞反应发生在一个完整的、非炎性的上皮屏障之内；即在没有感染的情况下，生理性的细菌定植促使皮肤屏障产生适应性免疫。

本研究旨在回答2个基本问题。

首先，机体皮肤屏障在面对细菌定植时，其"目标"为何？即细菌诱导的T细胞的功能特性如何？已知表皮葡萄球菌诱导的CD8+ T细胞具有促进皮肤稳态和加速伤口闭合的功能，这并非其常见功能。但是，这些细菌诱导的免疫细胞是否能够执行细胞免疫的核心功能？

其次，抗皮肤共生菌免疫可否用于某些皮肤免疫疾病的治疗？这或许是抗原特异性免疫又一重要应用。简单的细菌定植即可诱导特异性T细胞，这一过程作用持久、安全，避免了免疫刺激造成的副作用。

以上两个问题可以用同一方法来回答（图1A）。通过在表皮葡萄球菌中表达肿瘤抗原，诱导的T细胞因其皮肤共生菌而不受免疫刺激，但是能够特异性地识别肿瘤。如此便可观察这些T细胞是否能够浸润肿瘤，并参与对肿瘤的细胞毒性攻击。

本研究的第一步，就是构建表达肿瘤抗原的表皮葡萄球菌。

本研究选用了来自健康人皮肤的表皮葡萄球菌NIHLM087，该菌不会引发皮肤屏障的炎症反应。由于表皮葡萄球菌DNA导入特性，本研究使用了专门的DNA导入体系，通过大肠杆菌DC10B传代质粒、热休克和高渗山梨醇来达到较好的DNA导入效果（图1B），构建了13株突变的表皮葡萄球菌（图1C）。

接下来设计表皮葡萄球菌表达非天然抗原。先以卵清蛋白（OVA）作为模型抗原，产生3组抗原性质和定位不同的菌株（图1D）：第一组有1株，在胞质表达全长OVA（cOVA）；第二组有3株，在细胞壁上表达抗原（分别为S.epi-wOVA、S.epi-wOT-I和S.epi-wOT-II；w表示细胞壁）；第三组有3株，向细胞外分泌抗原（分别为S.epi-sOT-I、S.epi-sOT-II和S.epi-sOVA；s表示分泌）。以上工程菌在体外和皮肤上均可刺激抗原特异性CD8+和CD4+ T细胞，且无屏障破坏、不引发皮肤炎症。

工程表皮葡萄球菌是否可以天然诱导特异性T细胞、产生抗肿瘤活性？

小鼠接受表达OVA的黑色素瘤细胞皮下注射后，要么不做处理，要么用活的表皮葡萄球菌轻轻擦拭（图2A）。对照小鼠用的是一株表达无关蛋白的表皮葡萄球菌（S.epi-control）处理；实验小鼠用的是2组表皮葡萄球菌的组合处理，S.epiwOT-I和S.epi-sOVA（简称S.epi-OVA）以及S.epi-wOT-I和S.epi-sOT-II（简称S.epi-OVApep）。

S.epi-OVA或S.epi-OVApep定植明显抑制了肿瘤生长（图2B）。而S.epi-control没有影响肿瘤生长，说明抗肿瘤作用不是由于表皮葡萄球菌自身引起的CD8+ T细胞数量的增加或免疫应答的改变。表皮葡萄球菌只有在OVA存在时，才能发挥抗肿瘤活性。据此推测这种抗肿瘤作用是由OVA特异性T细胞介导。

工程菌不单纯起到抗原的作用，其生存能力、特殊生态位的占用和长期的抗原暴露可能是免疫刺激反应所必需的。因为热灭活的S.epi-OVApep无抗肿瘤反应（图2C），热灭活的S.epi-wOT-I在体内不能激活特异性T细胞。

表皮葡萄球菌诱导的OVA特异性T细胞可以迁移并浸润至肿瘤，不产生皮肤或全身毒性。S.epi-OVApep使OVA特异性CD8+ T细胞向肿瘤浸润，脾脏中OVA特异性CD8+和CD4+ T细胞增加（图2D）。肿瘤小鼠的皮肤中含有少量OVA特异性CD8 + T细胞，这些细胞倾向于产生IFN-g而不是IL-17A。

工程菌诱导抗肿瘤的最低要求是细胞壁表达CD8 +抗原和CD4 +抗原，仅有OVA特异性T细胞无抗肿瘤。去除S.epi-OVA感染的肿瘤小鼠的CD8+ T，效果相当于去除S.epi-OVA的定植（图2E）。当小鼠单独感染S.epi-wOT-I或S.epi-wOT-II时，对肿瘤生长无影响，表明抑制肿瘤生长必须存在OVA特异性CD4+和CD8+ T细胞。同时用S.epi-sOT-I和S.epi-wOT-II定植处理后，即便这些菌株能够诱导特异性T细胞，也失去了抗肿瘤作用(图2F）。

根据以上实验可知，S.epi-OVA诱导的T细胞可以限制皮下肿瘤的生长。那么，表皮葡萄球菌诱导的T细胞是否可以转运到其他组织？定植细菌的跨屏障移位可导致脓毒症，因此屏障免疫或许能够限制细菌的全身传播。

S.epi-OVA的抗肿瘤作用并不局限于皮肤和皮下组织。通过静脉注射表达OVA的黑色素瘤细胞，导致肺转移(图3A )。而在注射前用S.epi-OVA局部定植，能够显著减缓肿瘤生长（图3C）。

S.epi-OVA诱导的抗肿瘤反应的效果惊人。即使作为单药治疗，其诱导的T细胞也限制了侵袭性肿瘤的生长。同时该疗法作用温和，不会引起任何免疫副作用。

表皮葡萄球菌是否能诱导出针对肿瘤抗原的特异性T细胞？其抗肿瘤活性是否与OVA特异性T细胞相当？

本研究继续构建了表皮葡萄球菌工程菌，在其中表达了天然存在于黑色素瘤的2种抗原肽（命名为S.epi-neoAg）。这2种新抗原肽能够产生CD8+和CD4+ T细胞反应（图3B）。S.epi-neoAg的预防性定植可有效抑制随后的转移性肿瘤生长（图3A至C）。因此，皮肤共生细菌能够针对多种宿主抗原和不同的肿瘤环境，诱导相应的特异性T细胞。

肿瘤细胞生长之后，再用表皮葡萄球菌工程菌定植，是否也能够产生抗肿瘤作用？小鼠在肿瘤接种后3天，开始用S.epi-OVApep定植（图3D）。肿瘤生长的抑制与预防模型相当，同时肺和脾脏中OVA特异性CD8+ T细胞的增加。该结果支持S.epi-OVApep诱导的CD8+ T细胞对黑色素瘤的转移具有重要的控制作用。

S.epi-OVA诱导的和肿瘤诱导的T细胞虽然具有相同的抗原特异性，但是两者的功能不同。OVA特异性CD8+ T细胞群体的组成发生改变，对照组大部分为中央记忆性T细胞，而S.epi-OVApep组则为效应T细胞和效应记忆T细胞（图3E）。

肿瘤微环境中，可耗竭的效应T细胞和效应记忆T细胞可能介导了S.epi-OVA的抗肿瘤作用，并且浸润肿瘤的淋巴细胞（TILs）具有高比例的PD-1阳性。加入免疫检查点抑制剂可以缓解S.epi-OVA诱导的TILs耗竭，增强抗肿瘤作用。

单独的免疫检查点抑制剂对于表达OVA的黑色素瘤无作用，而S.epi-OVApep预防性定植联合免疫检查点阻断能够抑制黑色素瘤的生长（图4A）。首先在小鼠身体右侧注射黑色素瘤细胞，31天后在肿瘤完全消融的小鼠的左侧注射黑色素瘤细胞。所有小鼠均排斥左侧肿瘤，64.3%的小鼠在首次注射2个月后右侧无瘤（图4A）。此外，注射前25天时，接种黑色素瘤疫苗，减弱了S.epi-OVApep诱导的效应T细胞反应（图4B）。

工程表皮葡萄球菌和检查点抑制的组合是否可以治疗已有肿瘤？小鼠接种表达OVA的黑色素瘤细胞后的第5或14天，使用S.epi-control或S.epi-OVApep感染并使用免疫检查点抑制剂。肿瘤生长的抑制与预防模型一样明显，大部分肿瘤消退（图4C），并且无皮肤炎症。因此，将表达肿瘤抗原的皮肤共生细菌与免疫检查点抑制剂相结合，可以产生持久、有效的抗肿瘤反应，治疗已有的黑色素瘤。

教授介绍

通讯作者Michael Fischbach教授任职于美国斯坦福大学生物工程系，曾获美国国立卫生研究院（NIH）院长创新奖、霍华德休斯医学研究所（HHMI）和西蒙斯基金会联合颁发的学者奖等。

Michael Fischbach教授聚焦于人类微生物组，采用基因组学，从微生物中鉴定特征性小分子。

参考文献

Chen, Y. E., Bousbaine, D., Veinbachs, A., Atabakhsh, K., Dimas, A., Yu, V. K., Zhao, A., Enright, N. J., Nagashima, K., Belkaid, Y., & Fischbach, M. A. (2023). Engineered skin bacteria induce antitumor T cell responses against melanoma. Science (New York, N.Y.), 380(6641), 203–210. https://doi.org/10.1126/science.abp9563