Clinical significance and immune landscape of KIR2DL4 and the senescence-based signature in cutaneous melanoma

KIR2DL4和基于衰老的特征在皮肤黑色素瘤中的临床意义和免疫景观

发表期刊：Cancer Sci

发表日期：2022 Jul 18

影响因子：6.518

DOI:  10.1111/cas.15499

一、研究背景

        皮肤黑色素瘤是一种致命的皮肤癌，起源于皮肤中产生黑色素的黑色素细胞。虽然早期局部皮肤恶性黑色素瘤可以通过手术治愈，但转移性黑色素瘤的预后非常差。

        衰老在调节癌细胞方面起着重要作用。正常细胞的致癌性转化会导致衰老，并在初期阻止其生长。然而，恶性细胞通常通过基因突变或表观遗传学下调肿瘤抑制相关途径来绕过这一过程。与年龄相关的衰老相关的分泌表型（SASP）细胞的积累可以促进癌症的发展。此外，随着年龄的增长，衰老细胞的不断积累也带来了不良后果。

        皮肤黑色素瘤（CM）是一种复杂的肿瘤，需要多种环境和遗传因素来指导恶性特征的获得。KIR是一种由NK细胞和T细胞亚群表达的跨膜糖蛋白。KIR蛋白被认为在免疫反应的调节中起着重要作用。KIR2DL4，有两个Ig结构域和一个长的细胞质尾巴4，是KIR的一种类型，但它与CM的关系还没有研究。

二、材料与方法

1、数据来源

1）TCGA提供了一个TCGA-SKCM数据集作为训练队列，包含459个CM样本的基因表达矩阵及其相应的临床随访数据

2）GSE22153、GSE15605、GSE22154、GSE43955、GSE46517、GSE54467和GSE65904数据集从GEO数据库下载：GSE65904数据集，包含DSS（210名患者）和DMFS（150名患者）的信息，被用来作为测试队列；GSE22153、GSE22154、GSE46517和GSE54467数据集，仅包含OS数据（236名患者），被整合为验证队列

3）基因集：CellAge8包含279个衰老相关基因；从MSigDB数据库下载三个衰老基因集（GOBP_AGING、GOBP_CELL_AGING和GOBP_CELLULAR_SENESCENCE）

4）成都市第三人民医院病理科获得了2018年3月至2022年3月接受尼沃鲁单抗（NIVO）（PD-1抑制剂）和ipilimumab（IPI）（CTLA-4抑制剂）治疗的皮肤黑色素瘤患者的13份冷冻样本

2、分析流程

流程图

三、实验结果

01、TCGA-SKCM被划分为两个聚类

        首先，用UPSET筛选了TCGA、GSE22153、GSE22154、GSE46517、GSE54467和GSE65904数据库中共存的senescence-related genes（SRG），共发现221个SRG。然后，合并了GSE22153、GSE22154、GSE46517和GSE54467四个数据集，并消除了批次效应。合并数据集前后的主成分分析（PCA）结果显示，批次效应被很好地消除了。基于无监督聚类，TCGA-SKCM被划分为两个聚类（图1A,B）。根据两组之间的预后分析结果，聚类1在生存率和不复发方面表现出极大的优势（图1C,D）。图1E显示了一个多变量热图，其中包含了221个SRG的表达数据和临床病理数据。两个群组之间的多个SRGs存在明显的差异（图1F）。聚类2的病人的年龄明显高于聚类1的病人，因此作者将群组1和群组2分别标记为年轻组（YG）和老年组（OG）。

图1 SRG的无监督聚类

        作者分析了YG和OG之间58385个探针的差异表达，发现356个蛋白编码基因在OG中上调，1048个蛋白编码基因在YG中上调。对OG和YG中上调的基因分别用基因本体生物过程（GO-BP）和KEGG途径的功能富集分析。结果显示，YG中上调的基因主要集中在T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、淋巴细胞激活的正向调节、生物过程的正向调节、PD-L1表达和癌症中的PD-1检查点通路以及Th17细胞分化（图2A，B）。根据KEGG和GO-BP分析，OG中上调的基因主要集中在皮肤表皮发育、表皮发育调节、表皮细胞分化调节、IL-17信号通路、细胞外基质（ECM）-受体相互作用、皮肤发育和适应性免疫反应（图2C，D）。YG中上调的基因主要富集在免疫反应和免疫治疗途径中，而OG中的基因主要富集在衰老相关途径中，如细胞和表皮的发育和分化。因此，推测YG和OG之间的免疫景观和对免疫疗法的反应可能是不同的。

图2 YG和OG之间差异表达基因的富集分析

        基于TIDE分析的结果，进一步发现YG患者对免疫检查点阻断的反应明显高于OG（图3A,B）。此外，在接受免疫治疗和化疗的患者中，KM分析显示，YG患者对免疫治疗和化疗的反应明显优于OG患者（图3C，D）。此外，还比较了YG和OG之间B7家族和CD28家族的多个免疫检查点的表达。结果显示，YG的CD274、CTLA4、PDCD1、CD80、CD86、CD28、ICOS和ICOSLG的表达水平都明显高于OG（图3E）。为了探索免疫治疗反应和肿瘤免疫微环境之间的机制，进一步评估了两组之间肿瘤免疫微环境的差异。TME包含免疫、间质和内皮细胞，以及炎症介质和ECM分子。结果显示，YG患者的免疫、间质和ESTIMATE得分都明显高于OG患者（图S4A）。Xcell的结果验证了YG的肿瘤免疫微环境得分高于OG（图S5C）。通过KM分析，发现基质分数、免疫分数和ESTIMATE分数较高的CM患者的预后要好于分数较低的CM患者（图S4B-D）。

图3 OG和YG之间免疫治疗反应和免疫景观的差异

图S4 YG组与OG组免疫评分的差异

        基于不同免疫评分的患者的预后有很大不同，作者进一步探讨了两组患者之间的免疫浸润情况。通过对CIBERSORT和MCPcounter结果的比较分析，发现YG患者的CD8+T细胞、NK细胞、单核细胞系、巨噬细胞系和B细胞系的浸润丰度明显高于OG患者，而YG患者的中性粒细胞丰度则明显低于OG患者（图S6A,B,D）。然后，通过将免疫细胞作为预后因素，并结合预后数据，对每一类免疫细胞进行了单变量Cox回归分析。发现CD8+T细胞、NK细胞系、B细胞系、单核细胞系和巨噬细胞系与CM患者的预后较好有关（图S6C,E）。此外，比较了TIMER、EPIC和Xcell的结果，发现YG患者的CD8+T细胞、NK细胞、单核细胞系和B细胞系的丰度仍然明显高于OG患者（图S5A-C）。此外，OG患者中黑色素细胞浸润的丰富程度高于YG患者（图S5C）。单变量Cox分析还显示，B细胞、NK细胞、CD8+T细胞、B细胞系和树突状细胞的丰度与CM患者的预后较好有关。黑色素细胞的丰富程度与CM患者的预后差有关。

图S5 预测免疫细胞浸润的丰度

图S6 YG和OG共同免疫细胞浸润丰度的差异

        通过对YG和OG的体细胞突变分析，作者发现OG的总突变率和常见突变基因的突变率均低于YG（图S10A,B）。通过计算两组的肿瘤突变负荷分值，发现YG的TMB明显高于OG（图S10D）。KM分析显示，TMB高的CM患者的预后明显好于TMB低的CM患者（图S10C）。YG的NRAS突变率（21%）明显低于OG（38%）（图S10E）。

图S10 YG和OG之间的突变景观和TMB的差异

02、构建CM的RSS

        总共有94个使用单变量Cox回归分析选出的SRGs被纳入LASSO回归分析，选择四个分子，即IL15、B2M、FOXM1和KIR2DL4，进行多变量Cox回归分析。作者根据公式并按照风险得分的中位数计算RSS的风险得分，将训练队列和验证队列中的CM患者分为高风险得分组和低风险得分组（图S12A，B）。发现在训练队列和验证队列中，高危评分组和低危评分组的四个SRG的表达都有明显的差异（图S12C,D）。很明显，KIR2DL4在低风险分数组的表达明显高于高风险分数组。相反，FOXM1在低风险评分组的表达量明显低于高风险评分组。

图S12 风险评分、生存状态和基因表达水平的分布

        为了验证RSS的预后能力，进行了ROC和KM分析。在训练和验证队列中，低风险评分组的OS和无复发生存（RFS）明显优于高风险评分组（图S13A,C,D）。ROC分析结果显示，训练组和验证组的5年OS的AUC分别为0.711和0.830（图S13B，E）。为了进一步了解RSS对CM患者的DSS和DMFS是否有同样的预测作用，对测试队列（n = 210）进行了类似的分析。同样，高风险评分的CM患者的DSS和DMFS明显低于低风险评分的CM患者（图S13F，H）。此外，ROC分析显示，RSS预测CM患者3年DSS和DMFS的AUC分别为0.661和0.698（图S13G，I）。这些结果表明，RSS可以准确预测CM患者的预后。

图S13 SRGS对CM预后价值的验证

        基于TIDE分析的结果，进一步发现高危评分组的患者对免疫检查点阻断的反应明显低于低危评分组（图4B,C）。此外，对两组接受免疫治疗和化疗的患者的KM分析显示，低风险评分组对免疫治疗和化疗的反应明显好于高风险评分组（图4A，D）。此外，还比较了低风险评分组和高风险评分组之间B7家族和CD28家族中多个免疫检查点的表达差异。发现低危评分组的CD274、CTLA4、PDCD1、CD80、CD86、CD28、ICOS和ICOSLG的表达水平都明显高于高危评分组（图4E）。

图4 高风险和低风险评分组之间免疫治疗反应的差异

        根据GEPIA2的结果，CM患者的B2M、KIR2DL4和FOXM1的表达水平明显高于正常皮肤组织，但两组间IL15的表达没有明显差异（图5A）。接下来，在两个含有正常皮肤组织样本的CM队列中验证了这四个基因的表达。结果显示，B2M、FOXM1和KIR2DL4的表达水平在CM患者中仍然很高。令人惊讶的是，在GSE46517队列中，肿瘤组IL15的表达量明显高于正常皮肤组织（图5B,C）。

图5 CM组织和正常皮肤组织中RSS分子表达的差异

        在临床上，病理分期是影响CM患者生存的重要因素，而其他关键因素包括性别和年龄。因此，作者在训练和验证队列中验证了RSS预测不同分期、年龄和性别的CM患者的预后的能力。RSS对所有四个阶段、两种性别和两个年龄段（年龄≥65岁和年龄<65岁）的风险进行了准确分层。

03、KIR2DL4通过激活MEK/ERK途径激活NK细胞

        对13份冷冻样本进行了免疫组化和免疫荧光染色（图S15A，B）。很明显，免疫荧光的结果表明，KIR2DL4确实与NK细胞共存。免疫组化的结果显示，在13个标本中，7个标本的KIR2DL4高表达，6个低表达。KIR2DL4高表达的CM患者的OS时间明显长于KIR2DL4低表达的CM患者（图S15C）。此外，KM分析的结果也表明，KIR2DL4高表达的患者的OS比KIR2DL4低表达的患者要好（图S15D）。

        使用流式细胞仪从黑色素瘤组织中分离出NK细胞（图S15A）（分类-培养-再分类-再培养），首先探讨了KIR2DL4是否直接调节NK细胞的细胞溶解活性。用siRNA敲除了分离出的NK细胞的KIR2DL4，然后用乳酸脱氢酶（LDH）检测法清洗并与黑色素瘤细胞共培养，评估细胞的吞噬活性。如图S15B所示，与对照组相比，NK细胞的细胞溶解活性明显下降，最大杀伤率为对照组的1/4。接下来，用酶联免疫吸附试验（ELISA）来评估KIR2DL4对NK细胞中细胞因子产生的影响。如图S15C,D所示，KIR2DL4敲除后，NK细胞产生的IFN-γ和TNF-α明显减少。为了探索KIR2DL4如何激活NK细胞，作者构建了一个KIR2DL4的过表达质粒，并将其转染到NK细胞。结果显示，经典的NK细胞激活途径，即MEK/ERK信号途径被明显激活，过表达KIR2DL4后，磷酸化的MEK/ERK蛋白被明显上调（图S15E）。

图S15 免疫组织化学和免疫荧光

04、基于RSS和临床特征的nomogram

        为了进一步对CM患者的风险进行分层，验证RSS的预后预测能力，构建了一个预后nomogram。将四个变量，包括年龄、性别、分期和风险评分，纳入单变量和多变量Cox回归分析（图6A,B），风险评分与CM患者的不良预后独立相关。接下来，用这四个特征构建了一个预后nomogram，这个模型中的每个亚型的临床特征都对应着一个特定的分数（图6C）。所有临床因素的总分对应着具体的3年、5年和7年的生存概率。训练队列和验证队列的提名图的C指数分别为0.697和0.762。训练队列的校准曲线显示，预测值与3年、5年和7年OS的观察值一致（图6E）。根据nomogram模型中的每个预测因子计算出每个患者的总风险得分，并以总风险得分的中位数为分界值，将所有CM患者分为高风险患者和低风险患者。KM分析显示，高危患者的生存率明显低于低危患者（图6D）。ROC分析显示，总风险评分对CM患者3年、5年和7年预后的AUC值分别达到0.767、0.758和0.781（图6G）。此外，总风险评分的AUC值总是高于AJCC分期的值。最后，临床决策曲线分析显示，排除风险评分的模型的患者受益率明显低于排除AJCC分期的模型（图6F）。同时包括风险评分和AJCC分期的模型显示出最高的临床获益率。

图6 预测nomogram的构建和验证

        GSEA的结果显示，细胞周期通路在高风险评分组富集（图S18）。然而，在低风险分数组中富集的通路主要是免疫反应相关的通路，如T细胞受体信号通路、B细胞受体信号通路、NK细胞介导的细胞毒性、初级免疫缺陷。细胞粘附分子（CAM）、细胞因子-细胞因子受体相互作用、NOD样受体信号通路、PD-L1表达和癌症中的PD-1检查点通路、JAK/STAT信号通路和Toll样受体信号通路。这表明，低风险评分组的患者处于免疫激活状态，免疫治疗的效果更好。

图S18 GSEA

四、结论

        作者开发了一个新的RSS，它可以预测CM患者的预后和免疫治疗的效果。作为RSS的核心分子，KIR2DL4通过激活MEK/ERK通路激活NK细胞，因此促进了NK细胞释放细胞毒性因子，提高了NK细胞的细胞毒性活性。此外，构建了预后nomogram模型，以更好地对CM患者的风险进行分层，有效地指导临床决策。