Tracking cell-type-specific temporal dynamics in human and mouse brains
关键词： Neuron, TrackSci,scRNA-seq, scATAC-seq
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0092867423009765#fig3
一句话简介：通过开发名为TrackSci 的新技术，实现对人和小鼠大脑新生细胞的转录组和染色质可及性的表征。
图形摘要:
背景：
（1） 成年哺乳动物大脑中会不断生成新的神经元和胶质细胞，这是与记忆，学习，压力相关的关键过程。目前普遍认为，神经元和少突胶质细胞的生成会随着年龄的增长逐渐减少，但是下降到何种程度仍存在争议；
（2）此前，通过Div-seq(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5480621/)，一种基于Edu标记和 FACs的单细胞转录组测序技术，已经描绘了成人大脑中祖细胞的基因表达特征，但是对其表观遗传状态及其在衰老过程中的变化仍不清楚；因此，定量捕获新生细胞并追踪其转录组和染色质状态变化的新方法对于了解发育，衰老，疾病状态下的细胞群动态至关重要；
Single-cell combinatorial indexing VS 10x genomics single-cell sequencing
Single-cell combinatorial indexing: 通过组合索引组成细胞独特的barcode
10x genomics: 基于油包水技术每个细胞与独特的barcode反应
正文：
1. 基于TrackSci 获取的哺乳动物大脑新生细胞的全局概览
为了同时捕获大脑新生细胞的转录组和染色质状态变化，作者首先开发了一种名为TrackSci的新技术。这些技术受到了Div-seq的技术启发。其主要的工作流程包括(Fig 1A)：
（1）用Edu标记小鼠；
（2）提取脑核，固定，然后通过点击化学原位连接含叠氮化物的荧光基团，然后进行FACS 以富集Edu+ cells;
（3）通过两轮索引，进一步分选Edu+ cells
（4） single-cell combinatorial index RNA & ATAC sequencing
Figure 1.
利用这项技术，作者对Young, Adult, Age, 5xFAD 小鼠进行了 sciATAC & RNA seq , 分别捕获到了 14095 (RNA) 和 9316 (ATAC) 个细胞。然后对这些细胞数据进行了 Louvain 聚类和UMAP可视化(Fig 1B)。基于已有的细胞marker (Fig C)，在RNA水平鉴定了 16个clusters, ATAC水平鉴定了 14个 clusters，其中有两类细胞（室管膜细胞和脉络从上皮细胞）可能因为丰度较低，仅在RNA数据集中检测到。总体上，从两个分子层面定义的细胞类型重叠得很好，并且详细展示出了少突胶质细胞和神经元细胞的发生轨迹。
接着，作者观察到了Edu+ cells 与 全脑细胞在细胞类型组成比例上的显著差异。在全脑细胞中，成熟的神经元细胞（如小脑颗粒细胞）和分化的胶质细胞占主导地位，而前体细胞则很少。然而在Edu+ cells中，则富集到了大量的前体细胞，如少突胶质细胞OPCs, 嗅球神经母细胞等等。并且，他们还发现通过TrackSci流程进行的RNA/ATAC seq 在检测细胞比例变化上有着非常高的一致性。
然后，他们又将Edu + /Edu- cells细胞与小鼠全脑细胞转录组图谱进行了整合，发现Edu+ cells 形成桥接几种分化成熟细胞的连续细胞分化轨迹，包括从少突胶质前体细胞（OPC）到成熟少突胶质细胞的分化轨迹，以及从嗅球神经母细胞到嗅球神经元的分化轨迹等，但是这些“桥” 细胞在原先的图谱分析中是没有被发现的（Fig S1R）。
2. 鉴定新生细胞细胞类型特异性的表观状态和TF 调节因子
接下来，作者就对新生细胞进行了差异表达和差异可及性分析，产生了5610个差异基因和 68556个差异可及性位点。其中 1744（31%）的DE genes 在相同的细胞类型中具有对应的差异可及性promoter。这些细胞类型特异性基因的表达和对应启动子的染色质可及性展现出了良好的相关性（Fig 3A）。他们也检测到了许多尚未被全面表征，但是细胞类型特异性很高的marker genes. 例如 Sox2 和Dcx (Fig S2B)。
然后，为了进一步探究塑造新生细胞转录组的表观状态，作者鉴定了cell marker genes 细胞类型特异性表达背后的顺式调控元件。他们计算了88 个 pseudo-cells （按 k 均值聚类分组, 具有相邻综合 UMAP 坐标的细胞子集 -- 类似于 meta-cell） 之间基因表达和邻近位点可及性之间的相关性。在FDR=0.05的标准下，鉴定了 15485个基因和远端位点以及2832个基因和启动子之间的正连接(Fig 3B)。根据计算结果，大多数基因只与少数远端元件之间存在连接，中位数是每个基因和2个远端元件之间存在连接，例如Dlx2 基因。也有少数基因和多个远端位点之间存在连接，如 Olig2 基因（Fig 3C）。其中 Dlx2的基因表达，启动子可及性，连接的远端位点可及性都是在富集在神经元发生轨迹中，Olig2 基因都是富集在少突胶质细胞发生轨迹中。
接着，作者又计算了转录因子表达和motif可及性之间的相关性，然后鉴定了70 个细胞类型特异性的TF调节因子，包括19 个潜在的抑制因子和 51个潜在的激活因子(Fig 3D)。像Dlx2 的表达与motif的可及性呈正相关，而Olig2 的表达与motif可及性呈负相关（Fig 3F）。通过这种方法，作者发现了许多之间研究相对较少的细胞类型特异性转录因子，如Zfx, Pou6f1, Hmbox1等。
3. 成年阶段细胞类型特异性增殖速率的全球视角
在表征了新生细胞的转录组和表观状态之后，作者开始比较不同条件下细胞的增殖变化情况。通过比较年轻，成年，衰老和AD小鼠大脑中Edu+ cells的比例变化，他们发现大脑细胞的增殖随着年龄的增长而急剧下降(Fig 4A)。接着，他们从细胞类型层面量化了不同细胞类型增殖率在不同时期的变化倍数，检测到了各位祖细胞对衰老的高度异质性反应。例如在衰老小鼠中，齿状回神经母细胞的比例只有成年小鼠的1/18（Fig 4C）， 而血管细胞增殖仅受到轻微的影响。此外，小胶质细胞和免疫细胞可能由于衰老大脑中炎症反应的增加，它们的细胞增殖能力有所上升，在整体的细胞组成比例中也大幅增加 (Fig 4C,D)。
为了进一步验证大脑衰老过程中细胞类型特异性的动态，作者将TrackSci 收集的细胞与 小鼠全脑细胞图谱进行了整合和比较分析，整合分析促进了稀有祖细胞的鉴定，例如神经祖细胞（NPC），少突胶质细胞前体细胞（COP）。 这两类细胞在跨数据集中都展现出了随着衰老，细胞比例显著下降的趋势。而小胶质细胞在衰老小鼠表现出增殖增加。
此外，作者研究了衰老对祖细胞自我更新和分化潜能的影响，所谓的自我更新能力是新生成前体细胞与总前体细胞的比例，分化潜能是新产生的分化成熟的细胞和分化轨迹中所有新生成细胞的比例。结果显示，细胞的自我更新和分化潜能都随着衰老显著下降。
4. 衰老对成年小鼠神经发生的影响
接着，作者开始探究衰老对成年小鼠神经元和少突胶质细胞的发生的影响，并描绘潜在的转录和表观遗传调控程序。首先，他们通过RNA 速率分析确定了三条神经元分化的主要路径，即分化为齿状回母细胞，星型胶质细胞和嗅球神经母细胞的三条途径（Fig 5A）。他们收集了标记1，3，9day的样本进行了TrackSci分析，观察到随着时间的延长，更多分化成熟的细胞逐渐累积(Fig 5B)。通过差异表达分析，他们鉴定了随着齿状回和嗅球发育轨迹差异表达的基因。此外，他们也鉴定了在发育过程发生动态变化的可及性位点，并从中鉴定出了与神经发生密切相关的关键转录因子，20 TFs 与DG neurongenesis 相关， 283 TFs与 OB neurongenesis相关。这些转录因子的基因表达与motif（结合基序）的染色质可及性呈现出了很高的相关性（Fig 5C）。包括一些正调节因子如 Neurod1,Neurod2 ，以及抑制因子如Myt1l。
为了探究衰老对成年小鼠神经发生的影响，他们比较了在不同条件下，通过trackSci 转录组测序捕获到的，沿着神经发生轨迹的细胞密度。与先前细胞水平的分析相一致（Fig 4C），他们观察到了随着衰老，DGNB, NPC细胞密度的显著下降（Fig 5D）。 接着，他们使用milo 算法进行差异丰度比较分析，来鉴定随着衰老而显著改变的细胞邻域。然后，他们发现14个细胞邻域表现出了显著的下降，且主要来源于NPC，由此可见，衰老主要是通过下调祖细胞的增殖率来影响神经发生（Fig 5E）。
为了进一步探究NPC年龄依赖性变化的分子机制，作者又对年轻，成年和衰老小鼠的NPC细胞进行了差异表达分析，鉴定了30个随着时间推移显示出一致变化的基因，这些基因的表达和启动子的染色质可及性变化也是相符合的（Fig 5F），例如Nrg1 , Nrg3 两个神经营养因子，有报道称体内给予这两个因子可以促进神经元生成。
另外，作者也通过分析已经发表的实验数据进行了验证。该数据集采用了一种全基因组CRISPR 扫描的方法，可以通过定量基因特异性的sgRNA来系统评估基因在神经发生过程中的作用（Fig 5G) ^1。
1 The logic is that if the knockout of a gene results in a disadvantage for cell activation and proliferation, there will be fewer cells with that gene knocked out, leading to a lower enrichment of the corresponding sgRNA. Conversely, if knocking out a gene gives an advantage to activation and proliferation, cells with that gene knocked out will be more abundant, resulting in higher enrichment of the corresponding sgRNA.
他们比较了在此次研究中鉴定的衰老下调基因与随机挑选基因的sgRNA富集程度，发现这些衰老下调基因的富集程度显著低于对照组，因此，这一结果提示了这些基因的敲除会导致NPC的增殖受损。同样，他们也比较了在2021年已发表研究中通过CRISPR筛选的敲除后最可能导致神经发生损伤的基因在本次研究数据集中表达情况，发现这些基因都是随着衰老而表达下降（Fig 5H）。
5. 衰老对少突胶质细胞生成的影响
接下来，作者又探究了衰老对少突胶质细胞生成的影响。他们挑选了少突胶质细胞进行拟时序和轨迹推断分析，产生了一条简单的发育轨迹。并通过在Edu标记后第1天，第3天，第9天收样测序和细胞密度分析，验证了推断的发育轨迹。
同样的，他们又沿着发育轨迹进行了差异表达和差异可及性分析，鉴定了8443个差异表达基因和15164个差异可及性位点。通过计算TF和motif可及性之间的相关性，他们又从中挑选出了97个TF表达和motif可及性高度相关的组合。其中包括一些已知的少突胶质细胞发生相关调节因子，如Sox5,也包括一些尚未表征的新转录因子和潜在的抑制子。
然后，他们分析了不同条件下，少突胶质细胞发育轨迹上的细胞密度变化，并进行了与之前类似的细胞丰度差异分析，发现衰老时主要是COP（定型少突胶质前体细胞）数目下降，而早期的OPC（少突胶质祖细胞）变化并不显著（Fig 6D,6E）。这一观察与作者的一项配套研究和先前的报告中发现的衰老时新形成的少突胶质细胞耗竭相一致。
接着，为了进一步分析这一现象背后的分子机制，他们鉴定了随着衰老OPC中表达发生显著变化的基因。其中大部分的DE基因都得到基因表达水平和启动子可及性的双重验证。这些基因在功能上与细胞迁移，Ca2+通道，鞘磷脂代谢，还有细胞循环相关。
6. TrackSci 有助于识别老年人类大脑中的稀有祖细胞
接下来，作者试图研究TrackSci 数据集能否促进老年人类大脑中稀有祖细胞类型的鉴定。他们首先对 6个个体共29个老年人脑样本进行了单核RNA-seq，总共获得了798434个细胞的测序数据。由于衰老人脑中增殖细胞的稀有性，直接从原始的图谱中通过无监督聚类来鉴定循环细胞和分化细胞是非常困难的（Fig S7C）。
因此，作者将本研究中获得的小鼠 TrackSci 数据与人类大脑数据进行了整合，尽管存在跨物种的差异，整合的数据还是帮助鉴定了老年人类大脑中的罕见增殖细胞群。例如，他们鉴定了一群在人类与小鼠Edu+ cells重叠的循环细胞（Fig 7A），进一步的亚聚类分析又将这群细胞分成了 循环胶质细胞，Cycle OPC，Erythroblasts-Cycle （循环红细胞），这些细胞当中也表达典型的细胞周期相关基因（Fig 7B,7C）。
此外，整合分析还促进了典型细胞分化轨迹的鉴定。例如，在人类大脑数据中也鉴定到了连接OPC和成熟少突胶质细胞的COP。为了进一步探究少突胶质细胞生成过程中物种间保守的调控程序，他们整合小鼠和人类的数据，构建了一条平滑的细胞分化轨迹（Fig 7D）。并沿着分化轨迹，鉴定了人类中5680 个显著改变的基因，其中1162个基因在小鼠和人类当中是共享。其中包括一些其中报道了参与少突胶质细胞发生的关键调节因子，如TCF7L1,TCF7L2。同时，他们也鉴定了物种间特异的调控基因，发现人类特异性的基因在功能与核糖体发生相关，小鼠特异性的基因主要和miRNA的处理和 mRNA 3' end的处理相关(Fig 7E,7F)。
此外，他们也探究了少突胶质细胞发生在不同脑区之间的差异，发现所有小脑样本中的COP都是有所减少的(Fig 7G)。为了探索更深入的分子机制，他们进行了跨脑区的差异表达分析，分别鉴定了OPC, COP和OLG（少突胶质细胞）的区域差异基因，发现 45个OPC region specific genes中有 40 个是在小脑当中高度富集的。由此可见，小脑当中的OPCs 可能与其他区域的OPCs有着不一样的分子状态(Fig 7F,7H)。
Discussion
- 开发了一种能够表征体内前体细胞的异质性和动态的新型测序方法 – TrackSci ;
- 基于TrackSci 表征了小鼠不同年龄阶段的大脑前体细胞的转录组和染色质状态；
- 揭示了衰老相关的细胞类型特异性增殖和分化能力的改变；
- 展示了TrackSci 数据集作为跨物种罕见增殖或分化细胞鉴定的锚的能力。
