Basic Phage Isolation Techniques
基本噬菌体分离技术
环境样品（1）可以直接接种（2）到分离宿主细菌的平板上，或者首先富集（3）。在噬菌斑试验平板（4）中获得斑块，随后将噬菌斑纯化至少三次（5），然后使用纯斑块生产噬菌体原液（6）。
一、不同分离方法的偏差
分离噬菌体前需要考虑分离的目的，从而选择合适的方法。如果是为了探究环境中的优势噬菌体，那么就要在分离的时候避免培养富集，造成偏差。如果是为了筛选用于医疗的噬菌体，那么就要选择具有侵染特定菌株、或者寄主范围广等特点的噬菌体。
细菌宿主、培养基（包括营养成分、pH值、盐度类型和浓度、渗透压等）、培养温度和时间、氧含量和其他变量可能导致富集和分离过程中的选择偏差。
不同类型的噬菌体由于自身特点，在不同分离步骤中有所偏差。比如在空斑实验或噬菌体富集实验前需要用物理或化学方法（离心、过滤、氯仿处理）去除细菌菌体以及其他杂质。过度的离心会去除较大的噬菌体。氯仿可以非常有效地裂解细菌，去除活细菌并释放噬菌体，但它也可能对某些含有脂质衣壳（lipid capsid）的噬菌体有害，使之无法侵染宿主细菌。氯仿处理后一些噬菌体的尾部也会受害，降低噬菌体效价（phage titer）。当然，氯仿处理有利于专门分离一些对于氯仿不敏感的噬菌体。
样品的储存、冷冻甚至暴露在光线下也会使分离、富集的噬菌体类型产生偏差。这是因为不同的噬菌体会随着时间的推移或在不同的物理条件下表现出不同程度的耐久性（durability）。
二、噬菌体斑点试验（Spot Testing)
spot test是指在噬菌斑试验前，可以将少量（5-20 μl）未处理或富集后的噬菌体样品滴加在细菌平板上，以简单、快速地检测样品中是否有目标噬菌体，以及是否要用这个样品进行后续实验。与噬菌斑试验（plaque assay）不同，spot test产生的斑点可能由多种噬菌体引起，或者由样品中的一些次生代谢产物（造成此实验的假阳性）引起。
如果样品中噬菌体滴度合适，产生可以直接分离的噬菌斑，那么此时spot test可以代替plaque assay（如图2中白色箭头指示的区域）。 如果此实验没有产生斑点，还可能意味着样品可能需要富集、浓缩（见内容三）。
三、增加噬菌体浓度
对于一些噬菌体浓度很低的样品，想要分离噬菌体，首先要富集。
可以通过样品与目标细菌进行过夜液体摇培的方式富集。注意富集条件（培养基、培养温度、摇培时间、所用细菌等）不同，会造成从样品中富集的噬菌体的数量和组成有偏差。
还可以沉淀富集噬菌体，样品离心以除去碎屑，并通过 0.22 μm 膜过滤，再加入ZnCl2，并将溶液在37°C下孵育。在孵育过程中，噬菌体沉淀，然后通过离心，将噬菌体重悬于更小体积的缓冲液里，以达到浓缩的目的。
另一种浓缩噬菌体但不使用沉淀剂的方法是使用切向流过滤（TFF）。TFF的优点是在低噬菌体浓度下有效，例如噬菌体浓度太低而无法进行有效沉淀的淡水或盐水样品。
还有一些适用于富集少量、寄主特异性噬菌体的方法，比如将目标细菌寄主固定在0.45μm的滤膜上而不是涂布在固体培养基上，然后将预处理的（0.22 μm滤膜过滤）的噬菌体样品通过固定了目标细菌的滤膜。
四、获得分离毒株和噬菌体纯培养液
噬菌斑实验（plaque assay）分离噬菌体的关键步骤（即如图1的步骤2、4所示的噬菌斑实验），通过噬菌斑实验获得单个的斑块，再进行至少三轮的纯化（即如图1的步骤5），然后通过直接收集噬菌斑部分的琼脂或者用灭菌的牙签挑取，再放入缓冲液中来收集噬菌斑，一般认为通过以上步骤即可获得噬菌体的纯培养液。
如图3的噬菌斑平板中，黑色、红色和白色箭头所示的噬菌斑在形态上有明显的差别，说明样品未纯化成功。而图4则表明，样品纯化较好，可以挑取图4中白色箭头指示的独立的，而非叠加的噬菌斑进行后续实验。
五、保存噬菌体
按照上述方法，获得足够滴度的粗提裂解物（crude lysate），大多数情况下，经过简单的离心或者过滤，即可获得用于储存的噬菌体样品。
然而，粗提物中有一些杂质，比如外源DNA、内毒素、细菌素等，会影响样品的储存，纯化可以增强噬菌体溶液的稳定性。通常使用密度梯度超速离心来纯化噬菌体，这个在下方第二个演示视频中有提及。但是密度梯度离心得到的噬菌体量很小，还可以用更便宜的替代方案，比如阴离子交换色谱法或在高速离心之前使用聚乙二醇 （PEG） 沉淀噬菌体。
六、演示视频
演示视频1. 寻找和分离噬菌体
原视频链接：https://www.youtube.com/watch?v=Kt0miFrXMaY
演示视频2. 纯化噬菌体
原视频链接：https://www.youtube.com/watch?v=-t85C04Ueio
