A signature for pan-cancer prognosis based on neutrophil extracellular traps
基于中性粒细胞外陷阱的泛癌预后特征
发表期刊：J Immunother Cancer
发表日期：2022 Jun
DOI: 10.1136/jitc-2021-004210
一、背景
众所周知，肿瘤和宿主的免疫反应之间存在着持续的相互作用，从而加速了肿瘤的发展和进展。作为人类免疫系统中最丰富的细胞，中性粒细胞在肿瘤微环境中起着关键作用。中性粒细胞与淋巴细胞比值（NLR）的大多数临床证据支持中性粒细胞促进而不是抑制病情发展的观点。NLRs的增加反映了造血功能向骨髓系统的偏离，淋巴造血功能的下降，免疫系统功能的下降，以及预后的不良。
中性粒细胞胞外陷阱（NETs）是一种从垂死的中性粒细胞中排出的网状结构，由脱钙的DNA染色质组成，主要是为了杀死有害微生物。DNA染色质通过瓜氨酸化而分解，然后与瓜氨酸化的组蛋白和含有颗粒状酶的中性粒细胞胞质内容物一起从细胞中排出，这被称为 "NETosis"。髓过氧化物酶（MPO）被记录为形成NETs的一个基本要素，它是一种血红素过氧化物酶，主要储存在中性粒细胞的嗜氮颗粒中，当中性粒细胞受到刺激时分泌出来。
二、材料与方法
1.数据来源
1）TCGA，n=8739，涉及32种肿瘤，没有急性骨髓性白血病的样本；随机分配了70%的样本作为训练集（6117/8739），其余30%作为测试集（2622/8739）
2）从CGGA获取651个胶质瘤患者的样本用于研究，包括mRNAseq_693和mRNAseq_325的数据集，分别有422和229名患者
3）从cbioportal下载1868例METABRIC乳腺癌样本
4）从GEO数据库中检索并获得了非小细胞肺癌（NSCLC）和乳腺癌的数据，包括GSE12276（n=204），GSE17705（n=298），GSE19615（n=115），GSE21653（n=266），GSE2990（n=189），GSE6532_U133A（n=741），GSE7390（n=198），GSE8894（n=138），GSE43767（n=69），GSE19188（n=91）和GSE67061（n=150）
5）多个肿瘤组织微阵列的组织样本被用于临床验证，包含了肺腺癌（LUAD，58对）、三阴性乳腺癌（TNBC, 80对）、结肠腺癌（COAD，93个肿瘤样本和87个相应的邻近正常组织）和肾脏肾透明细胞癌（KIRC，90对）的肿瘤和邻近的正常组织
2.实验流程
1）NETs-最初的生物标志物：当NETosis发生时，死亡的中性粒细胞分泌出解聚的核染色质和混合的细胞质和颗粒成分；嗜中性粒细胞的基因集和NETosis相关基因集来自已发表的研究，共汇聚了69个基因作为NETs的初始生物标志物。
2）预后NETs相关特征的构建：对NETs相关基因采用了LASSO算法；Cox比例风险回归模型，以评估TCGA泛癌症训练系列中NETs特征的每个基因表达与患者疾病特异性生存（DSS）的关联
3）生物过程的z-score评价：过整合特征基因表达来反映特定途径的活性；采用R软件包GSVA中的z-score算法
4）使用组织微阵列分析和免疫组化染色进行验证
5）NETs得分高和低的患者之间不同表达的基因的功能注释: 使用R软件包'clusterProfiler'进行基因本体（GO）富集分析，基于高危组和低危组之间的差异表达基因（DEGs）
三、实验结果
01 - 鉴定19基因NETs相关特征的泛癌
首先，将69个NETs初始生物标志物输入TCGA泛癌训练集的LASSO回归分析中（图1A），得到24个系数不为零的NETs相关基因。随后，对这些基因进行了配对相关分析，发现一些基因有类似的表达模式（图1B）。CTSG和SELP、IL-6和IL-8、IL-6和FRP2、TLR4和FPR1、FCGR3B和FPR1、FCGR3B和FPR2、FPR1和FPR2之间的相关系数都比其他的高。因此，删除了CTSG、IL-6、TLR4、FPR1和FCGR3B，并使用剩余的19个NETs相关基因进行进一步的模型构建。对19个NETs相关基因进行Cox回归分析，并根据其归一化表达水平得出分数（NETs分数）。此外，还观察了每个基因对预后的风险比（HR）（图1C）。MPO在NETosis中十分重要，也参与了该模型。
NETs评分显示出明显的器官特异性，源自脑部和胃肠道的肿瘤通常具有较高的NETs评分，而来自一些分泌腺体的肿瘤，如前列腺腺癌、甲状腺癌和乳腺浸润癌（BRCA），通常具有较低的评分（图2A）。TCGA训练队列中的病人根据NETs评分中位数被分为高风险或低风险组。与低风险组的患者相比，高NETs评分的泛癌症患者与各种不良生存指标有关，包括DSS、总生存期（OS）和无进展间隔（PFI）（图2C）。NETs评分对各种预测预后的影响的单变量Cox分析结果显示，在大多数类型的癌症中，NETs评分与糟糕的预后有关（图2B）。
为了检验该特征的有效性和普遍性，作者在TCGA测试队列中验证了NETs评分的预后效果。与训练集的结果一致，测试队列中患者的生存分析显示，NETs评分越高，病情发展越差（图2D）。多变量Cox比例风险模型综合了NETs评分和癌症类型，表明NETs评分是TCGA测试队列中患者总生存期的一个独立预测因素。观察到NETs评分对各种肿瘤的预后有相当强的预测能力（图2E），包括KIRC、COAD和LUAD。然而，对于NETs评分相对较低的BRCA，NETs评分的预后预测价值无法在测试队列中再现。作为女性最常诊断的癌症，TCGA中有大量的BRCA样本数据，这就造成了训练队列的模型有很高的统计效率和过度拟合的事实。NETs评分对来自同一器官的癌症有不同的影响，它与肺腺癌（LUAD）患者的不利预后明显相关，但对肺鳞状细胞癌（LUSC）患者则没有影响，尽管后者的NETs评分比前者高（图2B），这表明NETosis在肿瘤进展中的作用不仅受其所在器官的影响，还与肿瘤的性质有关。
02 - 在其他独立的数据集中验证与NETs相关特征
为了进一步确认NETs评分的预后价值，作者将其应用于多个外部验证队列，并获得了类似的结果。从CGGA数据库中获得了651名胶质瘤mRNA矩阵和临床信息的患者，NETs评分较高的胶质瘤患者伴随着较差的预后，尤其是那些高等级疾病（III级或IV级，图3A）。外部验证表明，NETs评分不是乳腺癌的可靠预后预测指标，因为它在8个验证数据集中的7个中并不显著（图3B），这与TCGA队列的验证结果一致。收集了额外的NSCLC数据集以确认NETs评分对LUAD和LUSC患者的不同预后效果，同样发现NETs评分与LUAD患者的预后显著相关（图3C），但与LUSC患者无关（图3D）。
03 - 建立一个基于NETs评分的nomogram，用于临床预测泛癌的生存率
为了给NETs特征提供一个可读的定量测量，以临床预测不良事件的概率，构建了一个综合的nomogram，将NETs评分和几个临床病理特征相结合，包括患者的年龄和癌症类型（图4A）。图4B中绘制了3年DSS的校准曲线，几乎与标准曲线相吻合，是一条斜率为1的直线，通过坐标轴点，表明nomogram的特征与实际生存概率非常接近。如图4C所示，发现在训练集和测试队列中，nomogram预测的AUC优于单独的NETs评分，表明在考虑各种临床因素后，nomogram的预测效率会更好。此外，发现单独的NETs评分和综合列线图的净效益（NB）都高于0，在DCA临床评价中最大的NB大于15%（图4D，E），表明NETs评分与其他临床特征协调对预后预测的重要性。
04 - NETs特征和肿瘤的恶性特征
正常细胞在异化为恶性状态的过程中，获得了快速增殖、活跃的EMT和血管生成，这是恶性肿瘤的标志。为了研究NETosis和这些恶性特征之间的联系，通过z-score算法量化了肿瘤在NETs促进、血管生成、EMT和细胞周期方面的能力。发现在整个TCGA泛癌队列中（图5A-C），或在大多数肿瘤类型中（图5D、E），NETs z-score与血管生成z-core、EMT z-core和细胞周期z-core分别存在显著的正相关关系。换句话说，具有促NETosis的肿瘤一般伴随着微环境中更活跃的血管生成和及更具侵袭性的肿瘤细胞。这些结果表明，NETosis在肿瘤微环境中发生得越活跃，恶性细胞的作用就越积极。
为了进一步描述和比较高危和低危患者的肿瘤生物学行为和免疫微环境，从TCGA数据集中共提取了1599名LUAD、COAD、KIRC和TNBC患者。根据他们的NETs评分，按照最佳临界值将每种类型的肿瘤患者分为高危和低危组。高危组和低危组之间的DEGs被应用于GO富集分析。正如预期的那样，DEGs的特征与NETs形成过程的特征一致，如中性粒细胞激活、中性粒细胞脱颗粒和中性粒细胞介导的免疫，以及与肿瘤转移有关的步骤，如细胞粘附、细胞外组织和细胞外基质降解的正向调节（补充图S6）。
05 - 与NETs相关的基因在临床队列中的重新构建
建立NETs评分是为了根据几个转录物的表达水平来评估肿瘤中的NETostic潜力。为了更好地阐明NETs与患者预后之间的关系，作者将MPO和H3Cit这两个表明NETs形成的经典NETs标志物放入IHC验证中，涉及的肿瘤类型不仅包括NETs评分与患者的预后显著相关的KIRC、LUAD和COAD，还包括不相关的TNBC样本。结果证实MPO的染色模式主要是在肿瘤浸润基质细胞的细胞质中强烈而清晰（图6A），而在相邻的正常组织中则非常罕见。因此，作者采用基质细胞中MPO+细胞的比例得分（MPO得分）来衡量肿瘤组织中NETosis的程度。结果显示，MPO评分可以对COAD、KIRC和LUAD患者的预后进行分层（图6B-D），但在TNBC患者中不显著（图6E）。与TCGA队列中BRCA相对较低的NETs评分一致，观察到TNBC样本的MPO染色率明显低于LAUD、COAD和KIRC。然后对所有可用的临床指标进行单变量Cox分析，如性别、年龄、肿瘤、结节、转移（TNM）阶段和病理分化等，对具有统计学意义的指标进行后续多变量Cox回归分析。如森林图所示，MPO评分是影响COAD和KIRC患者预后的一个独立因素（图6F，G）。然而，作者发现在LUAD IHC队列中，MPO评分与TNM分期明显正相关，因此在多变量Cox模型中，MPO评分不是一个独立的预后因素（图6H）。
由于NETs评分模型是一个由多基因组成的评价系统，其中任何一个基因的表达水平都可能无法直接映射模型的预测。例如，由IL-17A编码的IL-17被认为是中性粒细胞的招募者和NETs启动子，因此最初被纳入模型的构建中，作为促进NETs形成的成分，然而IL-17A的系数在最终模型中变成了负数。推测可能与肿瘤组织中IL-17的来源广泛有关，这使该基因的生物学效应变得复杂。IHC结果表明，IL-17由各种类型的细胞表达，包括肿瘤细胞，与以前的报道一致。在本研究队列中，肿瘤组织中IL-17的总体水平与患者的临床结果无关。然而，肿瘤基质中IL-17+细胞的比例得分（IL-17评分）与MPO得分显著相关。可能与MPO评分一致，IL-17评分也是COAD和KIRC患者的独立预后因素（补充图S8A, B），因为IL-17评分越高，OS就越短（补充图S8C, D）。然而，LUAD患者的情况并不乐观，这可能是由于MPO评分在本研究LUAD队列中不是一个独立的预后因素，如前所述。IL-17和MPO评分的构成结果表明，是基质细胞而不是其他细胞表达IL-17，可能在促进NETosis方面有重要作用。因此，像IL-17A这样的单一基因在肿瘤组织中的整体表达水平可能不足以代表NETs评分模型的结果。
四、结论
NETs评分是根据LASSO Cox模型基于19-NETs相关基因计算的。在大多数癌症类型中，NETs评分被认为是一个危险因素，得分越高表明不良结局越差。NETs与各种恶性生物过程显著相关，例如上皮间充质转化，血管生成和肿瘤细胞增殖。此外，在各种肿瘤的IHC队列中，骨髓过氧化物酶（参与该模型的基因和NET形成的经典代表）与不良的临床结果相关。
总之，肿瘤组织的NETs形成潜力与许多恶性特征高度协调，并与泛癌症患者的临床结果有关。对肿瘤病变中的NETs形成进行评估和定位，可能会促进癌症的个性化治疗。
