今天给大家介绍一篇 2023 年发表在 Nature Communications 上的文章, 标题为:《Design and structural validation of peptide–drug conjugate ligands of the kappa-opioid receptor》。

导读

研究团队开发了一种计算方法，用于设计环状大分子肽与小分子阿片类药物的结合物。

实验中，研究者发现了适用于 κ-阿片受体（KOR）的骨架，并展示了其理想的药理活性。所设计的新型环状肽（DNCP）-β-纳洛酮（NalA）在体外展现出强效的 KOR 激动和 μ-阿片受体拮抗作用，具有纳摩尔级的结合亲和力。

概念验证的体内功效研究表明，DNCP-β-NalA(1) 在雄性小鼠中诱导了强效的 KOR 介导的镇痛作用。通过高分辨率冷冻电镜结构（2.6 Å）的 DNCP-β-NalA–KOR–Gi1 复合物和分子动力学模拟，研究者验证了计算设计模型的有效性。

蛋白质结构准备

KOR 蛋白

• 来源： 来自 PDB 的晶体结构。
• 修改： 为结构准备移除非必要部分。

配体参数化

• 配体 MP1104 修改： 产生一种新的化合物，CVV，用于结合。
• 使用工具： Open Babel 软件用于输入构象生成，Rosetta 用于分子模型构建。

肽设计与优化

• 方法论： 使用扭转仓位基聚类进行肽主链生成和对接。
• 选择标准： 形状互补性、结合能量和界面接触。

肽合成：逐步过程

采用的方法

• 合成技术： 使用手动和自动方法，包括 Liberty BlueTM 微波肽合成器。
• 肽变体： 合成不同类型的肽，包括 DNLPs 和 DNCPs。

质量控制

• 纯化与分析： 使用 RP-HPLC 和 ESI-MS 进行质量保证。
• 肽浓度测定： 利用分析型 RP-HPLC 和 Beer-Lambert 定律精确测量浓度。

动物和药物管理

药物效果和给药方式

• 测试药物： 实验药物如 DNCP-β-NalA(1) 及对照药物。
• 给药方式： 皮下注射生理盐水。

监测与分析

• 行为实验： 在光照周期内进行，确保一致性。
• 盲测研究设计： 消除对治疗效果评估的偏见。

细胞培养和膜制备

细胞系的培养与准备

• 细胞系： 使用 HEK293T 和 CHO-K1 细胞进行受体研究。
• 培养条件： 为每个细胞系维持最佳生长条件。

膜制备

• 程序： 通过匀浆和离心提取细胞膜。
• 蛋白分析： 使用 Bradford 方法确定蛋白含量。

体外和体内的药理实验

放射配体结合和 β-arrestin 招募实验

• 协议： 测量受体-配体相互作用和 β-arrestin 招募的既定程序。

• 数据分析： 使用非线性回归和放射配体结合研究。

cAMP 和 G 蛋白关联实验

• 功能性 cAMP 实验： 通过 HTRF 测量细胞内 cAMP 水平。
• G 蛋白关联： 计算 BRET 比率以评估 G 蛋白与 KOR 的相互作用。

血清稳定性和冷冻电镜研究

评估肽在人血清中的稳定性

• 方法： 将肽在人血清中孵育后进行 HPLC 分析。
• 结果： 确定肽在血清中的半衰期。

冷冻电子显微镜进行结构分析

• 冷冻电镜数据收集： 高分辨率成像，以阐明分子结构。
• 三维重建： 用于准确的结构表示。

分子动力学模拟

模拟设置

• 工具和参数： 使用 AMBER22 进行全原子模拟。
• 复合物准备： 在脂质双层膜中嵌入，以营造真实的模拟环境。

分析和可视化

• 模拟运行： 多次独立运行以获得稳健的数据。
• 数据解读： 专注于原子间相互作用和氢键。

主要结果概览

作者使用 Rosetta 多肽设计方法，开发了针对 Kappa 阿片受体（KOR）的循环多肽-小分子药物复合体。通过分析人类 KOR 与小分子 MP1104 结合结构，发现二者存在多重相互作用。基于这一发现，研究者推理出一个类似 MP1104 的小分子配体可以提高对 KOR 的亲和力，而相结合的循环多肽则可调节选择性和功效。

在化学合成过程中，选择了通过侧链和 N 端环化的套索多肽，并保留 C 端进行共价修饰，以提升结合亲和力和稳定性。研究团队首先基于 MP1104 衍生物，设计并合成了一系列循环硫醚多肽，并通过 Rosetta FastDesign 协议进行迭代设计，优化与 KOR 结合口袋的相互作用。这些设计经过形状互补性和界面面积评估后，筛选出最优结构。

随后合成了这些配体，并通过药理实验测定其在 KOR 上的药效学特性。结果显示，这些配体在 KOR 上表现出低纳摩尔级的亲和力和高效力。

此外，对 DNCP-β-NalA(1)进行了详细的药理学表征，获取其在 MOR 和 DOR 上的亲和力和激活情况信息。实验验证表明，这些配体在体外和体内均展现出优异的抗疼痛效果，且无典型的 KOR 介导副作用。

最后，通过高分辨率结构验证了计算设计的准确性，为评估计算设计分子的准确性提供了重要依据。通过分子动力学模拟，进一步探讨了配体与 KOR 结合时的稳定性和分子相互作用。

图 1: 计算设计硫醚环化肽-小分子结合物针对 KOR 的策略

• a. 以 3D 人类 KOR 结构和小分子激动剂 MP1104 为起始模板 (PDB ID: 6B73)。
• b. 计算肽-小分子结合物设计的工作流程：

1. 测量口袋面积（934 ų），缩小对 5 和 6 聚肽环化肽的关注。
2. 生成带有两个额外氨基酸的小分子，采样并评分以确定最佳二聚体序列（灰色：CVV-D-Phe-Thr; 黄色：CVV-D-Phe-Gln; 橙色：CVV-D-Phe-Ser; CVV 对应于 N-环丙甲基环氧吗啡小分子残基）。
3. 生成 5 和 6 聚体硫醚环化肽的全面库，通过扭转角和氢键模式进行聚类。
4. 通过坐标引导的骨架 C 端到生成的锚定 N 端的转换，对硫醚环化六聚体的结构进行对接。
5. 转变骨架设计以优化界面相互作用。
6. 基于形状互补性和界面面积进行设计过滤，作为界面指标的代表性示例；虚线红线表示第 90 百分位截止值。

图 2: 精选的肽环设计和合成策略概览

• a. 肽与 KOR 的 ECL2 和/或 ECL3 互作，部分肽骨架设计（片段锚）展示了口袋内的形状多样性。
• b. 最终选择的肽序列。我们寻求在不同形状和序列中选择设计进行实验测试，而不是专注于单一有希望的骨架的多个序列。
• c. 合成示意图描述了固相合成新线性肽（DNLP）（11-16）和新环肽（DNCP）（21-26 和 31-36），以及与 β-纳洛酰胺（β-NalA）的溶液相结合反应，生成 DNCP-β-NalA（1-6）结合物。

图 3: 体外受体药理学

• a、b. 在稳定表达小鼠 KOR 的 HEK293T 细胞膜上进行的放射配体结合（n=3）和功能性 cAMP 测定（n=3-4）（DNCP-βNalA 结合物 1-4）。结合（a）通过置换 1 nM 的 3HDPN 进行测量，而 cAMP 抑制（b）在用所述浓度的结合物处理后进行监测。U50,488 和 β-NalA 作为阳性对照。使用 10 μM 福斯克林刺激 cAMP 产生（补充表 3）。
• c. 在表达人类 KOR 的 CHO 细胞膜中，最有效的 DNCP-β-NalA(1)（n=3）、β-NalA（n=3）、U69,593（n=3）和 dyn A1-13（n=4）的 35SGTPγS 结合的浓度依赖性刺激（补充表 4）。
• d. 在暂时表达小鼠 KOR-EGFP 和 β-阿雷斯汀-2 纳米露西分酶的 HEK293T 细胞中进行的 DNCP-β-NalA(1)、β-NalA 和 dyn A1-13 的 β-阿雷斯汀-2 招募实验（n=3-6）（补充表 3）。
• e. 在 TRUPATH 实验中，对小鼠 KOR 的 DNCP-β-NalA(1)的 α 亚型筛选（n=8）（补充表 5 和 6）。
• f. 使用稳定表达小鼠 MOR 和 DOR 的 HEK293T 细胞膜制备和 1 nM [3 H]DPN 的放射配体结合实验，确定 DNCP-β-NalA(1)的选择性（n=3）。
• g、h. 在稳定表达 DAMGO 和 DADLE 作为参考配体的 HEK293T 细胞中，对小鼠 MOR（g）和 DOR（h）的 DNCP-β-NalA(1)的 Gαi 介导的 cAMP 抑制测定（n=3）。
• i、j. 来自 TRUPATH（每个 Gα n=8）、β-阿雷斯汀-1（n=4）和 β-阿雷斯汀-2（n=3-6）招募实验的蜘蛛图表示 DNCP-β-NalA(1)、U50,488、MP1104、戊唑辛、β-NalA 和 dyn A1-13 的效力（log EC50）（i）和标准化功效（j）。数据归一化为全 KOR 激动剂 U50,488、U69,593 或 dyn A1-13，全 MOR 激动剂 DAMGO 和全 DOR 激动剂 DADLE。所有数据均为平均值 ± s.e.m。源数据作为源数据文件提供。

图 4：雄性小鼠体内药理学研究

• 实验药物：DNCP-β-NalA(1)
• 给药方式：皮下注射
• 实验设计：
• a, b：福尔马林实验，药效剂量依赖性研究。实验组：生理盐水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （0.8 μmol kg−1, n = 6；1.9 μmol kg−1, n = 6；3.8 μmol kg−1, n = 6）及 U50,488（1.1 μmol kg−1, n = 6；2.1 μmol kg−1, n = 6；5.4 μmol kg−1, n = 6）。统计方法：单向方差分析（One-way ANOVA），F(3, 22) = 19.97, P < 0.0001 (a)；F(3, 22) = 27.10, P < 0.0001 (b)。
• c：福尔马林实验，nor-BNI 的拮抗作用。实验组：生理盐水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （3.8 μmol kg−1, n = 6）和 DNCP-β-NalA(1)+nor-BNI（3.8 μmol kg−1 + 13.6 μmol kg−1, n = 6）。统计方法：单向方差分析，F(2, 17) = 29.67, P < 0.0001。
• d, e：CFA 诱导的炎症性痛觉过敏，药效剂量和时间依赖性研究。实验组：生理盐水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （0.4 μmol kg−1, n = 6；0.8 μmol kg−1, n = 6；1.9 μmol kg−1, n = 6）和 U50,488（0.2 μmol kg−1, n = 6；0.6 μmol kg−1, n = 7；2.1 μmol kg−1, n = 8）。统计方法：两向方差分析（Two-way ANOVA），F(3, 176) = 46.10, P < 0.0001 (d)；F(3, 275) = 173.0, P < 0.0001 (e)。
• f：CFA 诱导的炎症性痛觉过敏，nor-BNI 的拮抗作用。实验组：生理盐水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （1.9 μmol kg−1, n = 6）和 DNCP-β-NalA(1)+nor-BNI（1.9 μmol kg−1 +13.6 μmol kg−1, n = 6）。统计方法：两向方差分析，F(2, 136) = 91.61, P < 0.0001。
• g, h：爪厚度，药效剂量依赖性研究。实验组：生理盐水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （0.8 μmol kg−1, n = 6；1.9 μmol kg−1, n = 6；3.8 μmol kg−1, n = 6）和 U50,488（1.1 μmol kg−1, n = 6；2.1 μmol kg−1, n = 6；5.4 μmol kg−1, n = 6）。统计方法：单向方差分析，F(3, 22) = 5.016, P = 0.0084 (g)；F(3, 22) = 1.770, P = 0.1823 (h)。
• i：爪厚度，nor-BNI 的拮抗作用。实验组：生理盐水（n = 8），DNCP-β-NalA(1) （3.8 μmol kg−1）和 DNCP-β-NalA(1)+nor-BNI（3.8 μmol kg−1 + 13.6 μmol kg−1, n = 6）。统计方法：单向方差分析，F(2, 17) = 7.239, P = 0.0053。
• j：旋转杆测试，运动协调性研究。实验组：生理盐水（n = 5），DNCP-β-NalA(1) （3.8 μmol kg−1, n = 6；7.6 μmol kg−1, n = 5）和 U50,488（5.4 μmol kg−1, n = 5）。统计方法：两向方差分析，F(3, 51) = 7.992, P = 0.0002。统计测试包括单向方差分析的 Dunnett’s (a, b, g, h) 和 Tukey’s (c, i) 后续检验；两向方差分析的 Bonferroni’s 后续检验 (d–f, j)。注：*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, 药物组与生理盐水组比较。

图 5：KOR-DNCP-β-NalA(1)-Gi1 复合体的冷冻电镜结构

• a：激活状态人类 KOR 与 DNCP-β-NalA(1)和 G 蛋白异三聚体（Gαi1, Gβ1, Gγ2）结合的总体结构。KOR-G 蛋白复合体通过单链抗体 scFv16 进一步稳定。右侧面板展示了 DNCP-βNalA(1)在 KOR 的结合姿态。展示了 KOR 正交结合口袋中极其保守的锚定残基 D138。
• b：DNCP-β-NalA(1)下半部分与 KOR 正交位点的相互作用。
• c：正交位点残基对 DNCP-β-NalA(1)介导的 Gαi1 蛋白和 β-arrestin-2 信号传导的影响（n = 3）。对于 KOR D138N 突变体，参考配体为 salvinorin A，因为 U50,488 在该突变体上无效。
• d：DNCP-β-NalA(1)肽环与 KOR 细胞外结合口袋 2 的相互作用。
• e：结合口袋 2 残基对 DNCP-β-NalA(1)介导的 Gαi1 蛋白和 β-arrestin-2 信号传导的影响（n = 3）。所有数据均以均值 ± 标准误差呈现。

总结

通过结合小分子 β-NalA 与环状肽类药物，显著提高了对 KOR（κ 阿片受体）的选择性和药效，为 G 蛋白偶联受体（GPCRs）药物开发提供了新的思路。

• 🧬 结构优化：通过小分子 β-NalA 与环状肽类药物的结合，优化了药物与 KOR 的相互作用。
• 💊 药效提升：开发的 DNCP-β-NalA(1)作为 KOR 的全激动剂，展现出纳摩尔级的活性和偏向 G 蛋白的药效。
• 🔬 实验验证：通过少量化合物的合成和特性化实验，快速发现高亲和力分子。
• 📉 副作用降低：DNCP-β-NalA(1)在活性和选择性上的优势，可能降低在体内的副作用。

• Muratspahić, E., Deibler, K., Han, J., Tomašević, N., Jadhav, K. B., Olivé-Marti, A.-L., Hochrainer, N., Hellinger, R., Koehbach, J., Fay, J. F., Rahman, M. H., Hegazy, L., Craven, T. W., Varga, B. R., Bhardwaj, G., Appourchaux, K., Majumdar, S., Muttenthaler, M., Hosseinzadeh, P., … Gruber, C. W. (2023). Design and structural validation of peptide–drug conjugate ligands of the kappa-opioid receptor. Nature Communications, 14(1). https://doi.org/10.1038/s41467-023-43718-w

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